氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹的检测方法研究

文英会，邱天宝，刘占通，吴慧豪

(1.河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450046；2.河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450008)

氟苯尼考粉是一种动物专用的酰胺醇类广谱抗生素[1]，对呼吸道和消化道疾病治疗效果明显。乙酰甲喹又称痢菌净[2]，具有广谱抗菌活性，主要用于雏鸡白痢、禽巴氏杆菌病的防治。兽药中非法添加现象时有发生，其中就包括氟苯尼考粉中存在非法添加物的现象[3]。个别生产企业为了提高防治疾病的效果或者减少不良反应，在氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹，隐藏了乙酰甲喹的使用，可能在动物源性食品中造成乙酰甲喹残留的严重后果[4]，这类不合规兽药给畜牧养殖业造成安全隐患，并对人类食品安全带来威胁。

目前，对氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹的检测暂无标准规定。基于当前的市场环境，建立一种相应的检测方法很有必要。本研究建立了高效液相色谱法对氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹的检测，可望对控制乙酰甲喹的非法添加起到作用。

1 材料

1.1 仪器

Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，配置UPLC PDA光电二极管阵列检测器/UPLC TUV紫外检测器；超纯水机(美国Millipore公司)；XS205电子天平(瑞士Mettler TOLEDO公司)。

1.2 试剂与材料

乙腈、甲醇、磷酸、三乙胺等；乙酰甲喹对照品：批号H0111505，含量99.6%，购自中国兽医药品监察所。

1.3 供试品

氟苯尼考粉样品，由河南某制药有限公司提供，规格100 g∶10 g，质量符合《中国兽药典》2020版一部质量标准，经检测不含乙酰甲喹，即为阴性样品。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

取乙酰甲喹对照品约10 mg于50 mL容量瓶中，加乙腈适量，超声10 min使其溶解，放冷至室温后用乙腈定容至刻度，摇匀，制成0.2 mg/mL的标准品贮备液。

2.2 供试品溶液的制备

取阴性样品约1 g于50 mL容量瓶中，加乙腈适量，超声15 min使其大部分溶解，放冷至室温后用乙腈定容至刻度，摇匀滤过，滤液作为供试品溶液。

2.3 色谱条件

流动相为乙腈-水(40∶60)；色谱柱：Waters XBridge C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长256 nm；流速1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温30 ℃。

2.4 系统适用性试验

分别精密量取2.1、2.2项下的溶液各1 mL于10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，量取10 μL注入高效液相色谱仪，再精密量取2.1项下的溶液1 mL于10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，量取10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

2.5 线性关系考察

精密量取2.1项下的标准品贮备液适量，用乙腈稀释成0.002、0.004、0.01、0.02、0.04 mg/mL的系列混合标准溶液，从低浓度到高浓度依次进样，按2.3项下的色谱条件进样分析，以标准溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，求得其线性回归方程。

2.6 添加回收试验

取2.2项下的供试品溶液，精密量取1 mL，加入10 mL容量瓶平行6份实验，在容量瓶中精密加入乙酰甲喹对照品溶液1 mL(相当于约0.2197 mg的乙酰甲喹)，用乙腈定容，精密吸取10 μL，按上述方法测定，计算其回收率。

2.7 检测限

将2.1项下的对照品溶液进行梯度稀释后添加到阴性氟苯尼考粉中，按2.3项下的方法进行检测，以乙酰甲喹光谱图不失真的最低添加含量作为检测限。

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，于制备后2 h、4 h、8 h、12 h、24 h注入高效液相色谱仪，在上述高效液相色谱条件下分别进行测定，计算乙酰甲喹峰面积的RSD值。

3 结果

3.1 系统适应性试验

在该色谱条件下，提取256 nm处的色谱图，按出峰时间的先后顺序依次为乙酰甲喹、氟苯尼考，理论塔板数高，相邻色谱峰的分离度符合要求，结果见表1，有关色谱图如图1，相应对照品的色谱图如图2。

表1 系统适应性实验数据

图1 乙酰甲喹和氟苯尼考混合溶液在256 nm的色谱图

图2 乙酰甲喹对照品溶液在256 nm的色谱图

3.2 线性关系考察

上机后不同的对照品浓度与相应的色谱峰面积如表2所示。

表2 不同对照品浓度与峰面积

以稀释后的标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，如图3所示，求得线性回归方程为Y=3.76×108X-8130及相关系数r=0.9999。结果表明，在该实验条件下，乙酰甲喹的浓度在0.002～0.04 mg/mL的浓度范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。

图3 乙酰甲喹对照品的标准曲线

3.3 添加回收试验

结果如表3所示，乙酰甲喹的回收率在99.0%～99.8%范围内，平均回收率在99.0%，RSD值为0.4%，符合回收率的范围，说明该法具有良好的回收率。

表3 乙酰甲喹回收率

3.4 检测限

将乙酰甲喹溶液进行梯度稀释后，记录乙酰甲喹的色谱图及光谱图，结果如图4、图5、图6、图7所示：当乙酰甲喹含量在0.2 mg/g、2 mg/g时，乙酰甲喹的色谱图以及紫外吸收光谱图均在理论范围之内，说明可以清楚地检测到乙酰甲喹。如图8、图9所示：当乙酰甲喹含量在0.02 mg/g时，乙酰甲喹的峰值、吸收波长均不符合标准，说明基本检测不到乙酰甲喹。故得出结论：本方法的检测限为0.2 mg/g。

图4 乙酰甲喹添加量为2 mg/g的乙酰甲喹色谱图

图5 乙酰甲喹添加量为2 mg/g的乙酰甲喹紫外吸收光谱图

图6 乙酰甲喹添加量为0.2 mg/g的乙酰甲喹色谱图

图7 乙酰甲喹添加量为0.2 mg/g的乙酰甲喹紫外吸收光谱图

图8 乙酰甲喹添加量为0.02 mg/g的乙酰甲喹色谱图

图9 乙酰甲喹添加量为0.02 mg/g的乙酰甲喹紫外吸收光谱图

3.5 稳定性实验结果

上机进样量均为10 μL，观察色谱图成峰效果，见表4。乙酰甲喹峰面积的RSD值为0.1%。这表明样品溶液在24 h内非常稳定。

表4 稳定性实验数据

4 讨论与小结

4.1 色谱条件、提取溶剂以及提取波长的选择

色谱条件的选择是参考了乙酰甲喹含量检测以及氟苯尼考粉中非法添加检测的相关文献[5-6]，再通过多次筛选，最后确立了合适的色谱条件；参考乙酰甲喹含量检测的相关文献，表明乙酰甲喹在波长为256 nm处有最大吸收峰值，通过实验选择检测波长为256 nm。由乙酰甲喹的性质得知，乙酰甲喹溶于甲醇，且甲醇又是流动相，所以选择甲醇为提取溶剂。

4.2 检测限的确立

方法采用PDA检测器，对乙酰甲喹定性定量的同时进行测定，节约了时间。由于需要对乙酰甲喹先进行定性检测，所以与传统含量测定方法(信号和噪声的比例为3∶1)不同，方法以光谱图未失真时的乙酰甲喹含量作为检测限。

4.3 方法评价

本研究建立了氟苯尼考粉中非法添加乙酰甲喹测定的高效液相色谱方法。该方法简便快捷，灵敏度高，准确性强，可以有效检测氟苯尼考粉中非法添加的乙酰甲喹，为氟苯尼考粉的质量标准修订提供了参考。