基于质量源于设计理念的智脑胶囊醇提工艺研究

张艳艳，刘 睿，杨文明，刘晓闯，韩燕全

（1.安徽中医药大学第一附属医院 药学部，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥230012；3.安徽中医药大学 新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥 230012；4.安徽中医药大学第一附属医院 国家中医药管理局中药制剂三级实验室 中药复方安徽省重点实验室 现代药物制剂安徽省工程技术中心，安徽 合肥 230031）

质量源于设计（QbD）是一种从设计初期通过试验设计确定关键工艺参数（CPPs）和关键质量属性（CQAs），建立满足药品质量要求且稳定的工艺设计空间，用设计空间确定其质量控制策略和药品质量体系[1]。智脑胶囊系安徽省中医院国家级重点专科脑病科的特色制剂，主治阿尔兹海默病（AD），临床应用近20 年疗效确切，该处方由八味中药组成，其中以黄芪、党参、肉苁蓉为君药，具有健脾益肾、豁痰化瘀、开窍健脑之功效[2]。本研究基于 QbD 理念对智脑胶囊提取工艺进行优化，保证该制剂提取工艺稳定、质量可靠。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Acquity 超高液相色谱仪（美国Waters 公司）；ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1 mm ×100 mm，1.8-Micron）（美国安捷伦科技公司）；1510型酶标仪（赛默飞世尔科技公司）。

1.1.2 试药 党参（批号：2101091）、黄芪（批号：2011113）、酒黄精（批号：2010133）、肉苁蓉（批号：2012012）、郁金（批号：2012043）、石菖蒲（批号：2101062）、川芎（批号：2010251）、地龙（批号：2004221）均由安徽普仁中药饮品有限公司提供，经安徽中医药大学第一附属医院韩燕全主任中药师鉴定为正品，松果菊苷对照品（批号：111670-200503）、毛蕊异黄酮苷（批号：111920-201505） 、阿魏酸对照品（批号：110773-201915）、党参炔苷对照品（批号：DSTDD003501）均购于中国食品药品检定研究院；D-无水葡萄糖（批号：C12301890，Macklin 公司）；乙腈（色谱纯，Acetonitrile 公司）；甲醇（色谱纯，Sigma-Aldrich 公司）；超纯水为实验室自制；其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 利用网络药理学结合文献调研确定CQAs

通过TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）数据库，设定OB ≥30% 、DL ≥0.18[3]为条件筛选出智脑胶囊各味中药的活性成分共54 个以及对应靶点278 个，在UniProt（https://www.uniprot.org/）数据库检索确认智脑胶囊活性成分对应基因24 个；通过GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库[4]，以Score ≥10 为条件筛选得到疾病AD 对应的基因1 482 个；用Venny 图取智脑胶囊与AD 共同作用基因交集，见图1。使用Cytoscape v_3.7.2 软件构建活性成分-疾病基因的网络图，确定智脑胶囊中毛蕊异黄酮（MOL000417）等54 个关键成分作用于AD 10个基因，见图1。结合文献调研，最终确定以固体物质提取量、多糖含量、松果菊苷[5]、党参炔苷[6]、毛蕊异黄酮苷[7]、阿魏酸[8]含量为智脑胶囊的CQAs。

图1 智脑胶囊中活性成分基因与AD 基因的Venny 图及活性成分-疾病基因网络图Fig. 1 Venny diagram of active ingredient gene and AD gene in Zhinao capsule and active ingredient disease gene network diagram

1.2.2 CPPs 的筛选及风险评估 使用鱼骨图为关键工艺风险标识手段来确定潜在关键工艺参数（pCPPs）[9]。采用失效模式及效应分析方法（FMEA）对鱼骨图提供的因素进行筛选，采用风险优先系数（RPN）作为FMEA 的评价指标，见图2。基于文献调研和提取经验，对智脑胶囊的提取工艺中失效事件发生频率（P）、严重程度（S）、可检测程度（N）进行估计，根据公式RPN = S × P × N 计算出风险优先系数。并将每个单元按照影响大小从低到高分为1 ～ 10个等级，根据RPN = S × P × N 公式计算出风险优先数值，将RPN 按照低水平（RPN ＜ 100）、中水平（100 ＜RPN ＜ 500）、高水平（RPN ＞ 500）分为3 个等级[9]。

图2 智脑胶囊提取工艺参数风险鱼骨图Fig. 2 Fish bone diagram of extraction process parameters of Zhinao capsule

根据表1 的RPN 值，得出提取次数、提取时间、乙醇浓度、液料比处于高水平，因此将这4 个因素作为智脑胶囊提取工艺的CPPs 进行考察。

表1 智脑胶囊提取工艺潜在关键参数风险评估表Tab. 1 Risk assessment of potential key parameters of Zhinao capsule extraction process

1.2.3 响应面实验设计 基于以上分析，以浸膏得率（Y1）、多糖含量（Y2）、松果菊苷（Y3）、毛蕊异黄酮苷（Y4）、阿魏酸（Y5）、党参炔苷（Y6）为CQAs，以提取次数（X1）、乙醇浓度（X2）、提取时间（X3）和液料比（X4）作为CPPs。结合前期预实验，以CQAs 为影响因素、CPPs 为评价指标进行Box-Behnken 设计，利用实验设计软件Design-Expert 10 设计安排四因素三水平试验[10]，按表2 设计的因素水平取智脑胶囊处方量药材共计33.3 g，加热回流提取过滤，合并滤液，旋转蒸发仪在60 ℃、40 rpm的条件下浓缩，用容量瓶将浓缩液定容至50 mL，得各组样品溶液。

表2 Box-Behnken 工艺参数及水平Tab. 2 Box-Behnken process parameters and level

1.2.4 供试品溶液的制备 取各组样品溶液适量，12 000 r/min 离心5 min，0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

1.2.5 多糖对照品溶液的制备 精密称定干燥至恒重的葡萄糖标准品粉末0.1 g，加蒸馏水定容至50 mL容量瓶中，配制成2 mg/mL 的葡萄糖对照品溶液。

1.2.6 指标成分对照品溶液制备 精密称取适量松果菊苷、毛蕊异黄酮苷、阿魏酸、党参炔苷对照品，得到浓度依次为 0.042 mg/mL、1.203 mg/mL、0.195 mg/mL、0.581mg/mL 的对照品溶液。

1.2.7 混合标准品配制 分别精密量取“1.2.6”项下方法制备的对照品溶液：松果菊苷对照品50 μL、毛蕊异黄酮苷对照品50 μL、阿魏酸对照品100 μL、党参炔苷对照品20 μL，置于5 mL 容量瓶用甲醇定容至刻度，即得混合标准品溶液。

1.2.8 多糖含量测定 精密吸取“1.2.4”项下方法制备的供试品溶液0.2 mL，转移至2 mL 离心管中，加无水乙醇定容，12 000 r/min 离心5 min，弃去上清液，离心管底部沉淀物用无水乙醇反复洗涤至无色，N2挥干乙醇，将沉淀物加蒸馏水溶解并转移至容量瓶中定容至25 mL，精密吸取各组供试品溶液0.5 mL，以蒸馏水为空白组，并将各组供试品溶液置于10 mL具塞刻度试管，在490 nm 处测其吸光度值。根据回归方程计算供试品溶液多糖含量[11]。

1.2.9 指标成分含量测定 分别量取“1.2.6”项下方法制备的供试品溶液适量，用UPLC 检测指标成分含量，检测波长为260 nm，进样量为2 μL，流速为0.25 mg/mL，柱温为30 ℃。

1.2.10 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8-Micron）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）[7,12-14]，洗脱梯度见表3。

表3 样品洗脱梯度Tab. 3 Sample elution gradient

1.2.11 浸膏含量测定 取各组样品溶液10 mL 置于干燥至恒重的蒸发皿中，105 ℃干燥 5 h，移至干燥器中冷却 30 min，迅速精密称定并计算浸膏得率[15]。

2 结果与分析

2.1 多糖含量测定及标准曲线绘制

精密吸取葡萄糖对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于10 mL 具塞试管中，加入1 mL 现配的5%苯酚溶液和5 mL 浓硫酸，加蒸馏水定容至10 mL，摇匀，50°C 水浴加热20 min，取出后冰浴10 min，用蒸馏水作为空白对照组，用酶标仪测定吸光度。以吸光度（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，得回归方程为：Y= 1.819 5X- 0.421 8，R2= 0.999 4，表明在0.08 ～ 0.24 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.2 指标成分含量测定及标准曲线绘制

精密量取各对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL，按“1.2.10”项下色谱条件测定松果菊糖、阿魏酸、党参炔苷以及毛蕊异黄酮苷峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标，得回归方程，结果R2均大于0.999，表明各成分在各自范围内线性关系良好，见表4。

表4 智脑胶囊线性关系测定结果Tab. 4 Determination results of linear relationship of Zhinao capsule

2.3 醇提工艺的Box-Behnken 实验设计

在“1.2.10”色谱条件下，供试品中松果菊苷、毛蕊异黄酮苷、阿魏酸、党参炔苷色谱峰之间分离度良好且无其它峰干扰，出峰时间与对照品、混合对照品出峰时间基本一致，见图3。

图3 智脑胶囊UPLC 图Fig. 3 UPLC diagram of Zhinao capsule

Y1-Y6为响应值的四因素三水平的实验结果见表5，对实验结果进行方差分析，见表6。通过分析，固体物质提取量的一次项和二项式回归总模型方差显著（P＜ 0.05），失拟值不显著（P＞ 0.05），一次项模型的失拟值小于二次项模型，因此选择二次项模型。Y2、Y3、Y4含量一项式方差不显著（P＞ 0.05），二项式回归总模型方差显著（P＜ 0.05）且失拟值不显著（P＞ 0.05），因此选用二次项模型。Y5、Y6总模型方差均不显著（P＞ 0.05），准确的关系模型无法建立。模型信噪比S/N ＞ 4,表明模型的预测精密度良好,可以用于设计空间。4 个因素对各个物质含量影响程度见表7，其中，X3在3 个模型中P＜ 0.05，表明提取时间对Y1、Y2、Y3影响明显。

表5 智脑胶囊四因素三水平的实验结果Tab. 5 Experimental results of Zhinao capsule

表6 智脑胶囊 Box-Behnken 实验结果方差结果Tab. 6 Variance results of Box-Behnken experiment of Zhinao capsule

表7 4 种因素对物质含量影响程度Tab. 7 Influence degree of four factors on substance content

2.4 模型评价

采用二项式回归对4 个CQAs 及对应的CPPs 进行数据拟合，得按编码因素计算的最终回归方程如下：

对Box-Behnken 设计结果进行方差分析，Y1-Y4的二项式回归总模型方差显著且失拟值不显著，具有统计学意义，其拟合系数R2分别是0.806 4、0.720 8、0.735 4、0.730 8分别是0.612 7、0.441 6、0.470 8、0.461 5，拟合度良好。

2.5 响应面分析

从成分等高线图4 分析，浸膏得率随乙醇浓度升高而减少，随提取次数、提取时间、液料比的增加而增加。多糖含量随乙醇浓度增加而减少，随提取次数增加而增加。松果菊苷成分含量随提取次数、液料比、提取时间增加而增加，在乙醇浓度75%左右时松果菊苷成分含量最高。毛蕊异黄酮苷含量随提取次数、液料比增加而增加，随着乙醇浓度增加而减少。以上分析结果与方差分析结果一致。

图4 CPPs 和CQAs 相互关系等高线图Fig. 4 Contour map of the relationship between CPPs and CQAs

2.6 建立设计空间及验证

设定各成分提取含量最大值的55%为优化目标，即X1≥20.16 % ，Y2≥123.48 μg，Y3≥226.88 μg，Y4≥2 971.21 μg 构建设计空间取置信水平α = 0.05，用Overlay Plot 展示，如图5，黄色区域为智脑胶囊提取工艺的设计空间：X1为1.72 ～ 3.17 次、X2为68.37% ～77.30%、X3为57.10 ～ 86.16 min、X4为9.52倍～ 10.74 倍。结合工艺生产实际情况，最终确定智脑胶囊最佳醇提工艺为X1为2 次、X2为75%、X3为60 min、X4为10 倍。

图5 智脑胶囊醇提工艺设计空间Fig. 5 Design space of alcohol extraction process of Zhinao capsule

取空间内、空间外、置信区间内共6 个点进行验证，验证结果见表8，结果表明在空间内、置信区 间 内 均 能 满 足Y1≥20.16%、Y2≥123.48 μg，Y3≥226.88 μg、Y4≥2 971.22 μg，达到预期设计目标，空间外则不能完全满足上述条件。

表8 智脑胶囊空间设计验证及结果Tab.8 Space design verification and results of Zhinao capsule

3 讨论

本实验选择浸膏得率、多糖含量和各指标成分含量为关键质量属性。浸膏得率能反应中药复方制剂提取效果。方剂中药多糖类成分含量高，故选择多糖含量作为检测指标。松果菊苷、阿魏酸、党参炔苷分别为2020 年版《中国药典》中肉苁蓉、川芎、党参的质控检测指标，毛蕊异黄酮苷是网络药理学筛选与疾病AD 的治疗密切相关的成分。最终将固体物质提取量、多糖含量、松果菊苷、党参炔苷、毛蕊异黄酮苷、阿魏酸含量作为智脑胶囊的关键质量属性。

本实验中阿魏酸和党参炔苷含量总模型方差不显著，数据分析显示阿魏酸在75%乙醇浓度最高，但是趋势不明显，可能与阿魏酸同时易溶于热水、乙醇溶剂的性质有关。党参炔苷在本实验中随着提取时间增加浓度呈下降趋势，而在60% ～ 90%乙醇浓度范围内，党参炔苷含量随乙醇浓度提高而缓慢增加，可能与党参炔苷易溶于乙醇难溶于水，并随着温度升高而分解有关。

4 结论

本实验基于QbD 理念，运用网络药理和文献调研确定关键质量参数，通过Box-Behnken 设计优化智脑胶囊提取工艺，建立了工艺生产设计空间，验证结果与预测结果基本一致，说明提取工艺稳定有效，为药品制剂工艺开发和质量控制提供参考。后期可以通过UPLC-Q-TOF-MS 对该药进行全成分分析，结合体内体外实验进一步确定智脑胶囊治疗AD的有效成分。