基于指纹图谱结合化学模式识别评价益胃汤标准汤剂及配方颗粒的差异

陈 婷，钱博文，唐 樑，黄玉宇，沈夕坤，成旭东

(南京中医药大学附属苏州市中医医院 药学部，江苏 苏州 215009)

益胃汤源自《温病条辨》[1]，由沙参、玉竹、地黄、麦冬4 味中药组成，主治阳明温病，适用胃阴损伤证。现代研究表明，益胃汤对慢性萎缩性胃炎[2]、消化性溃疡[3-4]、脾胃虚弱[5]、糖尿病[6]等有显著的临床疗效。标准汤剂[7]系遵循中医药理论，经规范化煎煮，适用固-液分离技术后适当浓缩制得的一类汤剂，可以用作标准参照物来对其它剂型与临床汤剂的一致性进行评价。但传统汤剂有不便携带、不耐贮存、口感差等缺点，为了解决传统汤剂的固有缺点，中药配方颗粒应运而生。中药配方颗粒是将饮片经过一定加工步骤后制得的一种单味药材新剂型，与临床常见的经典汤剂相比，具有调剂使用携带方便、便于辨证施治、灵活组方的特点，发展二十多年来越来越受到临床医患认可。但自二十世纪九十年代我国开始研究配方颗粒以来，学界对此的争议就从未停止，其重点就在于分煎后合并的中药配方颗粒与合煎的传统汤剂在药效物质基础和临床疗效上是否一致[7]。截至目前，未有文献对益胃汤标准汤剂与配方颗粒一致性进行评估，本研究希望借助HPLC 指纹图谱相似度，结合聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多元统计分析[8-9]，比较配方颗粒及标准汤剂中化学成分的差异，以期为其生产工艺及质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；KDC-140HR 型超速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；Milli-Q Synthesis108 型超纯水仪（美国密理博公司）；KQ-100VDE 型超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；AG285 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试剂与药物

毛蕊花糖苷对照品（批号：111530-201713，纯度：98.6%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck 公司），磷酸为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材及颗粒

中药饮片共4 味药，各3 批，南沙参（批号：2019100501、2019090941、20190601），玉竹（批号：19111066-1、19111066-2、19111066-3），地黄（批号：19302、191111、191101），麦冬（批号：20031037-1、20031037-2、20031037-3）。配方颗粒得率与饮片一一对应，南沙参配方颗粒得率分别为49.78%、44.53%、43.41%（批号：1912222、1912223、1912224），玉竹得率均为83.80%（批号：1912113、1912114、1912115），地黄得率分别为69.33%、57.33%、62.67%（批号：1912204、1912205、1912206），麦冬得率均为90.00%（批号：2003110、2003111、2003112），以上饮片与配方颗粒均由江阴天江药业提供。随机组合平行制备标准汤剂10 批，记为S1-S10，相对应的配方颗粒，记为P1-P10。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脱（0 ～ 12 min，3%→10%A；12 ～ 45 min，10%→25%A ；45 ～ 58 min，25%→80%A，58 ～60 min，80%→1%A）；流速：1 mL/min；检测波长：334 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2 样品的制备

2.2.1 标准汤剂制备 将各单味药随机组合成共10 批组方，按益胃汤处方量（南沙参9 g，麦冬15 g，生地15 g，玉竹4.5 g） 称取药材43.5 g，加10 倍量水，浸泡30 min，武火煮沸后改用文火，煎煮30 min，滤过，剩余药渣加8 倍量水，煎煮15 min，滤过，合并滤液，浓缩至100 mL，得标准汤剂。

2.2.2 配方颗粒汤剂的制备 分别称取与饮片批号相对应的10 批配方颗粒组方，根据各味药材配方颗粒的得率，分别称取相应重量的配方颗粒，加适量温水溶解至无明显残渣，定容至100 mL 容量瓶，得配方颗粒汤剂。

2.2.3 单味药材汤剂的制备 按照各单味药所占比例，分别称取南沙参、麦冬、生地、玉竹，按照“2.2.1”项下方法制备，得单味药材汤剂。

2.2.4 共煎配方颗粒汤剂的制备 根据各味药材配方颗粒的得率，分别称取3 批相应质量的配方颗粒，加入500 mL 蒸馏水，文火煎煮30 min，定容至100 mL 容量瓶。

2.3 供试品溶液的制备

依次精密吸取标准汤剂、配方颗粒汤剂、共煎配方颗粒汤剂、单味药材汤剂各5 mL 于10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，超声处理（180 W，45 kHz，20 ℃）15 min，补足失重，以10 000 r/min 离心5 min，取上清液，过0.45 μm 微孔滤膜，即得供试品溶液。标准汤剂供试品溶液记为S1-S10，配方颗粒供试品溶液记为P1-P10，共煎配方颗粒供试品溶液记为G1-G3，单味药材汤剂供试品溶液分别为地黄、玉竹、沙参、麦冬药材供试品溶液。

2.4 对照品溶液的制备

精密称取毛蕊花糖苷对照品适量，加入甲醇超声溶解，并定容至刻度，配制成质量浓度为16.4 μg/mL的对照品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液S1，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。以毛蕊花糖苷为参照峰，计算得共有峰相对保留时间的RSD 值小于0.55%，相对峰面积的RSD值小于3.12%；相似度大于0.99；毛蕊花糖苷峰面积RSD 为0.78%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 称取同一批次样品6 份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以毛蕊花糖苷为参照峰，计算得共有峰相对保留时间的RSD 值小于0.43%，相对峰面积的RSD 值小于3.11%；相似度大于0.99；毛蕊花糖苷峰面积的RSD 为0.97%，表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液S1，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图。以毛蕊花糖苷为参照峰，计算得共有峰相对保留时间的RSD 值小于0.43%，相对峰面积的RSD 值小于4.11%；相似度大于0.99；毛蕊花糖苷峰面积的RSD 为1.27%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液（1、2、4、6、8 和10 mL），加甲醇稀释配制成6 个系列浓度的毛蕊花糖苷对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以毛蕊花糖苷对照品浓度X（μg/mL）及峰面积Y进行线性回归，绘制得标准曲线Y= 15.947X+ 7.623 1，r= 0.999 5，表明毛蕊花糖苷在1.64 ～ 16.4 μg/mL 范围内线性关系良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密量取6 份已测含量的同一批益胃汤标准汤剂溶液（S1）2.5 mL，精密加入毛蕊花糖苷（34.7 μg/mL）标准品1 mL，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，计算毛蕊花糖苷的平均加样回收率为99.01%，RSD 为1.71%。

2.6 益胃汤指纹图谱的建立及共有峰的确定

2.6.1 样品测定与指纹图谱的建立 按“2.1”项下色谱条件，分别测定S1-S10、P1-P10、G1-G3 和对照品溶液，并记录色谱图。将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”分析，分别以S1、P1、G1 为参照峰，时间窗为0.1 min，多点校正法自动匹配分析，Mark 峰匹配，用中位数法自动生成标准汤剂、配方颗粒及共煎配方颗粒的色谱叠加图及相对应的对照图谱，见图1-3。

图1 10 批益胃汤标准汤剂的指纹图谱与对照图谱Fig. 1 Fingerprint and control atlas R of 10 batches of Yiweitang standard decoction

图2 10 批益胃汤配方颗粒的指纹图谱与对照图谱Fig. 2 Fingerprint and control atlas R of 10 batches of Yiweitang formula granule

图3 3 批益胃汤共煎配方颗粒的指纹图谱与对照图谱Fig. 3 Fingerprint and control atlas R of 3 batches of Yiweitang co-decocted formula granule

2.6.2 相关性研究 通过与对照品比对，指认15号峰为毛蕊花糖苷，因其峰面积较大，出峰时间适中，分离度良好，故以此为参照峰，见图4。10 批标准汤剂S1-S10 具有15 个特征峰，10 批配方颗粒P1-P10 有20 个特征峰，3 批共煎配方颗粒汤剂中也存在20 个特征峰，共煎后对成分的变化影响不大。在10 批标准汤剂中，均未检测出2、4 号峰，部分批次可检测出5、7、9 号峰，可能在高温过程中会发生成分间络合、吸附、沉淀、分解等，引起成分溶出量的减少[10]。经相似度评价软件计算，S1-S10 的相似度为0.952 ～ 0.989，P1-P10 的相似度为0.981 ～0.990，说明标准汤剂组、配方颗粒组及共煎颗粒组的组间相似性较高。将标准汤剂的对照图谱、P1-P10 及G1-G3 导入相似度评价软件进行比较，经计算，P1-P10、G1-G3 与标准汤剂的共有模式的相似度为0.962 ～ 0.996。传统的相似度评价表明配方颗粒和汤剂相似度良好，无法找出差异信息，具有局限性，因此本研究希望通过结合化学模式识别方法，全面评价益胃汤标准汤剂和配方颗粒的差异性。

图4 标准汤剂、配方颗粒剂、共煎颗粒剂共有模式及标准品HPLC 色谱图Fig. 4 HPLC of standard decoction, formula granule, co-decocted formula granule and reference

2.6.3 特征峰的归属 分别吸取单味药、配方颗粒供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，获得相应的色谱图，通过比较光谱吸收与保留时间，对指纹图谱中的20 个特征峰进行归属。结果特征峰数量最多的药材是地黄：1、3、11、13、14、15、16、17、18、19、20 号峰均为地黄特征峰；排名第二的是沙参：2、3、4、5、7、9、12、14、17 号峰均为沙参特征峰，其次是麦冬和玉竹，20 个特征峰均为处方中各药材的峰，具体见图5 及表1。与标准汤剂的色谱峰相比，共煎汤剂可能会引起沙参、玉竹部分成分的降解或转化。

表1 各峰归属情况Tab. 1 Attribution of peaks

图5 单味药及配方颗粒供试品溶液HPLC 色谱图Fig. 5 HPLC of test solution of single Chinese medicine and formula granules

2.6.4 毛蕊花糖苷含量的比较 运用t检验评价益胃汤标准汤剂和配方颗粒中毛蕊花糖苷的含量差异。S1-S10 中毛蕊花糖苷平均含量为16.61 μg/mL，P1-P10 中毛蕊花糖苷平均含量为13.72 μg/mL，S1-S10 与P1-P10 比较有差异（P＜ 0.05），且S1-S10的毛蕊花糖苷含量更高，说明复方煎煮过程中，因各成分之间会相互增溶，可能会导致毛蕊花糖苷的溶出度增加。

2.7 化学模式识别分析

2.7.1 聚 类 分 析（CA） 以S1-S10、P1-P10 及G1-G3 共计23 批样品的共有峰峰面积为变量，标准化处理后进行聚类热图分析，见图6，每一行代表一个样本，每一列代表一个特征峰。总体来看，纵向样品聚类可将23 批样品分为2 类，标准汤剂S1-S10聚为一类，配方颗粒P1-P10 及G1-G3 聚为一类；横向特征峰聚类显示15、11、13 号峰峰面积相对较高。聚类热图能有效区分益胃汤标准汤剂与配方颗粒。

图6 聚类热图Fig. 6 Clustering heat map

2.7.2 主成分分析（PCA） PCA 将复杂数据降维分析，直观呈现数据间的分类信息，在中药质量评价中被广泛地运用[11]。为综合评价益胃汤配方颗粒与标准汤剂的差异及引起差异的物质基础成分，将S1-S10 和P1-P10、G1-G3 的共有峰面积标准化后，采用SIMCA（Version14.1）软件进行PCA 分析。从20 个变量中提取出5 个变量，累计方差贡献值为84.575%，见表2。根据主成分载荷矩阵，推测多个成分都会对益胃汤标准汤剂和配方颗粒差异性产生影响，见表3。色谱峰2、3、5、6、17 在主成分1 中的权重较大，15、18 号峰在主成分2 中贡献值较大。提取前2 个主成分做PCA 得分图，见图7，可知23批供试品可被分为2 大类，其中，S1-S10 分布在第2、3 象限且较为分散，而P1-P10、G1-G3 均分布在第1、4 象限，且较为集中。结果表明，共煎配方颗粒组与配方颗粒组无差别，与标准汤剂组差别较大。

图7 PCA 得分图Fig. 7 PCA score chart

表2 特征值与方差贡献率Tab. 2 Feature value and variance contribution rate

表3 载荷矩阵Tab. 3 Load matrix table

2.7.3 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA） 为进一步分析标准汤剂和配方颗粒间的差异性，采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）对数据进行有监督的分析[11]。关键参数R2X= 0.533，R2Y= 0.709，Q2= 0.637，均大于0.5，说明预测模型有较强的预测及拟合能力，见图8。由OPLS-DA 图可知23 批样本被显著分为2 类，与PCA 的结果一致，见图9。各变量以变量投影重要度（VIP）大小进行排序，见图10。以VIP ＞1 为标准，确认2、5、3、4、6、17、10、12 号峰为区分益胃汤标准汤剂与配方颗粒的标志性成分，对分类结果有显著影响，各成分有待采用LC-MS 等技术明确具体的化学成分。

图8 模型验证图Fig. 8 Model verification diagram

图9 OPLS-DA 得分图Fig. 9 OPLS-DA score chart

图10 VIP 值Fig. 10 VIP value

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本方法考察了甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水和乙腈-0.05%甲酸水等流动相系统，并根据组方药材的主要化学成分设定了334、254、280、203、265、245、270 nm，7 个波长进行筛选检测，结果表明在乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱条件下，以334 nm 作为检测波长，基线稳定，色谱峰数量多、峰形好、分离度高，能够满足指纹图谱对色谱峰的要求。

3.2 标准汤剂与配方颗粒差异性分析

本研究建立了益胃汤标准汤剂和配方颗粒的指纹图谱，利用“整体性”及“模糊性”特点，全面反映内在化学特征。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”软件比较S1-S10、P1-P10及G1-G3 指纹图谱，P1-P10 与G1-G3 在特征峰的种类、数目及含量上差别不大，标准汤剂S1-S10 与配方颗粒相比未检测出2、4 号峰，部分样品缺5、7、9 号峰。标准汤剂组的组内相似度相对较低，说明各批次标准汤剂的差异较大，可能与药材本身质量及煎煮工艺不稳定有关。配方颗粒组与标准汤剂组相比，组内相似度明显上升，说明配方颗粒的制剂方法良好，制剂工艺稳定，质量较为稳定。益胃汤标准汤剂组与配方颗粒组相似度较高，因此为了寻找差异性信息，本研究结合CA、PCA 及OPLS-DA，全面评价配方颗粒及汤剂。CA、PCA 及OPLS-DA 能显著地将二者区分开来，结合2、5、3、4、6、17、10、12号峰的VIP 值大于1，说明这8 种成分为标准汤剂和配方颗粒的主要差异性成分。

4 结论

本研究建立了益胃汤HPLC 指纹图谱，通过相似度评价与化学模式识别方法，对二者指纹图谱的有效信息进行充分提取及分析，全面评价标准汤剂与配方颗粒的差异，为配方颗粒生产工艺优化及质量监督工作提供参考。但本研究仅从体外化学成分层面对两者进行比较太过局限，因此课题组后期将从入血成分及相应的药效学层面深入探讨，以获取标准汤剂与配方颗粒的差异规律。