MT 浸种对Cu 胁迫下远志种子萌发及类黄酮代谢的影响

梁泰帅，赵肖琼

（1.山西医科大学 药学院，山西 太原 030001；2. 太原工业学院 环境与安全工程系，山西 太原 030008）

2020 年版《中国药典》（一部）中规定远志为远志科植物远志Polygala tenuifoliaWild.或卵叶远志Polygala sibiricaL.的干燥根，主要以干燥的根皮入药，并以筒粗、肉厚、去净木心者为佳，具有安神益智、交通心肾、祛痰、消肿的功效[1]。山西是全国远志药材产量最大的省份，能够供应市场80%左右的远志，其中，运城市闻喜县、新绛县是传统栽培远志的主产区[2]。Cu是环境中被广泛关注的重金属污染物之一[3]。近年来，由于工业含Cu2+“三废”的肆意排放以及农业含Cu2+杀虫剂和除草剂的过度使用[4]，使得土壤Cu 污染问题日趋加重，据统计山西省土壤中重金属Cu 的平均含量为土壤环境背景值的1.35 倍[5]，在一定程度上影响着远志药材的安全生产以及远志产业的可持续发展。

褪黑素（MT）普遍存在于各类高等植物体内，是一种新型的植物生理调节激素，能够通过诱导防御基因表达、提升抗氧化酶活性及渗透调节能力等机制，增强植物对干旱、强光、高盐等非生物胁迫的耐性[6]。然而目前鲜见关于MT 缓解远志Cu 胁迫的报道，因此本试验以远志种子为材料，探讨外源不同浓度MT 浸种对Cu 胁迫下远志种子萌发、幼苗生长、MDA含量、类黄酮含量及其合成关键酶活性的影响，为药材安全生产过程中合理使用化学调控手段增强药用植物植株对Cu 胁迫的耐受性提供新思路。

1 材料和方法

1.1 试验材料

远志种子购自山西省运城市新绛县永信中药材种植专业合作社，经山西医科大学刘恩荔副教授鉴定为远志Polygala tenuifoliaWild.的种子。

1.2 试验设计

1.2.1 Cu 胁迫处理浓度的筛选 选择大小一致、颗粒饱满的远志种子，置于2%的NaClO 浸泡消毒15 min，蒸馏水洗净后继续用蒸馏水浸种24 h，晾干种子表面水分后均匀摆放于垫有双层滤纸的培养皿中，然后分别加入20 mL 浓度分别为0（蒸馏水）、5、25、50、100、200、400 mg/L 的CuSO4溶液，每皿50 粒，每个处理设置3 次重复，置于25 ℃、光照12 h 的培养箱中培养。以种子发芽长度超过1 mm为发芽标准，每天记录种子发芽情况，培养9 d 后统计发芽率，每皿随机取5 株幼苗测量其苗高、根长和鲜重，烘干至恒重后再测定幼苗干重。

1.2.2 MT 浸种和Cu 胁迫处理 远志种子按照“1.2.1”项方法进行消毒和培养，先用浓度分别为0（蒸 馏 水）、5、25、50、100、200、400 μmol/L 的MT 浸种24 h，随后向培养皿内分别加入20 mL 浓度为100 mg/L 的CuSO4溶液（依据“1.2.1”项下方法筛选结果），以蒸馏水浸种和培养发芽为CK，每个处理设置3 次重复，第5 天计算发芽势，第9 天计算发芽率、发芽指数和活力指数，每皿随机取5 株幼苗测量其苗高、根长、鲜重和干重。

1.3 指标测定

按照赵停等[7]的方法统计种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数。采用梁泰帅等[8]的方法测定幼苗的丙二醛（MDA）、类黄酮含量及类黄酮合成关键酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）、4-香豆酰辅酶A 连接酶（4CL）的活性。

1.4 统计学方法

用SPSS 19.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Cu 胁迫处理对远志种子萌发及幼苗生长的影响

远志种子发芽率及幼苗苗高、根长、鲜重、干重均随着Cu 胁迫浓度的增加呈先升高后降低趋势，当Cu 胁迫浓度为5 mg/L 时，发芽率等指标较CK 均增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）；当Cu 胁迫浓度为100 mg/L 时，发芽率、苗高、根长、鲜重及干重较CK 分别下降了36.26%、45.70%、41.20%、43.69%和43.57%（P＜0.05），明显抑制了远志种子萌发及幼苗生长；而当Cu 胁迫浓度为200 和400 mg/L时，发芽率等指标较CK 的下降率均超过了50%（Cu胁迫浓度为200 mg/L 时的发芽率除外），严重抑制了远志种子萌发及幼苗生长，见表1。因此，选定100 mg/L作为远志种子及幼苗耐受Cu 胁迫的敏感浓度。

表1 不同浓度Cu 胁迫处理对远志种子萌发及幼苗生长的影响（±s，n = 3）Tab. 1 Effects of different concentrations of Cu stress on seed germination and seedling growth of Polygala tenuifolia（±s，n = 3）

表1 不同浓度Cu 胁迫处理对远志种子萌发及幼苗生长的影响（±s，n = 3）Tab. 1 Effects of different concentrations of Cu stress on seed germination and seedling growth of Polygala tenuifolia（±s，n = 3）

注：同列字母完全不同，表示差异有统计学意义（P ＜0.05），下表同。

处理 发芽率 / % 苗高 / cm 根长 / cm 鲜重 / mg 干重 / mg CK 60.67 ± 5.03ab 0.50 ± 0.02a 3.45 ± 0.10a 48.90 ± 1.11a 4.67 ± 0.40a Cu（5 mg/L） 63.33 ± 1.15a 0.52 ± 0.01a 3.64 ± 0.07a 50.43 ± 0.65a 4.87 ± 0.21a Cu（25 mg/L） 56.67 ± 1.15b 0.47 ± 0.02b 3.24 ± 0.11b 42.33 ± 1.08b 3.87 ± 0.21b Cu（50 mg/L） 46.67 ± 1.15c 0.37 ± 0.01c 2.61 ± 0.15c 31.77 ± 1.19c 3.37 ± 0.12c Cu（100 mg/L） 38.67 ± 3.06d 0.27 ± 0.01d 2.03 ± 0.19d 27.53 ± 1.03d 2.63 ± 0.12d Cu（200 mg/L） 30.67 ± 1.15e 0.22 ± 0.02e 1.47 ± 0.06e 20.03 ± 1.10e 1.93 ± 0.15e Cu（400 mg/L） 23.33 ± 2.31f 0.13 ± 0.02f 1.14 ± 0.08f 12.43 ± 0.71f 0.93 ± 0.15f F 110.549 310.174 214.689 630.959 134.897 P 0.003 0.000 0.000 0.000 0.002

2.2 不同浓度MT 浸种对Cu 胁迫下远志种子萌发的影响

与单一的Cu 胁迫相比，MT 浸种能够不同程度促进Cu 胁迫下远志种子的萌发，且发芽势等指标均随着MT 浓度的增加呈先升高后降低趋势，当MT浸种浓度为100 μmol/L 时，发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数较单一的Cu 胁迫分别明显增加了52.00%、46.55%、54.56% 和144.52%（P＜0.05），增幅最大，见表2。

表2 不同浓度MT 浸种对Cu 胁迫下远志种子萌发的影响（±s，n = 3）Tab. 2 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on seed germination of Polygala tenuifolia under Cu stress（±s，n = 3）

表2 不同浓度MT 浸种对Cu 胁迫下远志种子萌发的影响（±s，n = 3）Tab. 2 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on seed germination of Polygala tenuifolia under Cu stress（±s，n = 3）

处理 发芽势 / % 发芽率 / % 发芽指数 活力指数CK 54.67 ± 2.31a 60.67 ± 5.03a 8.42 ± 0.59a 28.97 ± 1.13a Cu 33.33 ± 2.31f 38.67 ± 3.06e 5.10 ± 0.22f 10.35 ± 1.09f Cu+MT（5 μmol/L） 38.67 ± 3.06e 42.67 ± 1.15de 5.74 ± 0.07e 12.85 ± 0.51e Cu+MT（25 μmol/L） 40.67 ± 3.06de 46.00 ± 2.00d 6.28 ± 0.19d 16.16 ± 0.46d Cu+MT（50 μmol/L） 44.67 ± 3.06cd 50.67 ± 2.31c 7.09 ± 0.15c 20.74 ± 0.55c Cu+MT（100 μmol/L） 50.67 ± 2.31ab 56.67 ± 1.15ab 7.89 ± 0.11b 25.30 ± 1.07b Cu+MT（200 μmol/L） 47.33 ± 3.06bc 55.33 ± 2.31b 7.28 ± 0.37c 22.15 ± 1.61c Cu+MT（400 μmol/L） 40.67 ± 1.15de 44.67 ± 2.31d 6.02 ± 0.17de 16.79 ± 0.46d F 20.948 24.581 48.119 131.993 P 0.003 0.000 0.000 0.000

2.3 不同浓度MT 浸种对Cu 胁迫下远志幼苗生长的影响

与单一的Cu 胁迫相比，MT 浸种能够不同程度促进Cu 胁迫下远志幼苗的生长，且苗高、根长、鲜重和干重均随着MT 浓度的增加呈先升高后降低趋势，当MT 浸种浓度为100 μmol/L 时，苗高、根长、鲜重和干重较单一的Cu 胁迫分别明显增加了63.41%、58.22%、54.96%和49.37%（P＜0.05），增幅最大，见表3。

表3 不同浓度MT 浸种对Cu 胁迫下远志幼苗生长的影响（±s，n = 3）Tab. 3 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on seedling growth of Polygala tenuifolia under Cu stress（±s，n = 3）

表3 不同浓度MT 浸种对Cu 胁迫下远志幼苗生长的影响（±s，n = 3）Tab. 3 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on seedling growth of Polygala tenuifolia under Cu stress（±s，n = 3）

处理 苗高 / cm 根长 / cm 鲜重 / mg 干重 / mg CK 0.50 ± 0.02a 3.45 ± 0.10a 48.90 ± 1.11a 4.67 ± 0.40a Cu 0.27 ± 0.01e 2.03 ± 0.19g 27.53 ± 1.03f 2.63 ± 0.12d Cu+MT（5 μmol/L） 0.30 ± 0.02e 2.24 ± 0.11f 29.77 ± 1.35e 2.87 ± 0.21d Cu+MT（25 μmol/L） 0.34 ± 0.02d 2.57 ± 0.10e 32.43 ± 0.91d 3.23 ± 0.12c Cu+MT（50 μmol/L） 0.37 ± 0.01c 2.93 ± 0.14cd 37.53 ± 1.03c 3.63 ± 0.12b Cu+MT（100 μmol/L） 0.45 ± 0.02b 3.21 ± 0.09b 42.67 ± 0.51b 3.93 ± 0.21b Cu+MT（200 μmol/L） 0.43 ± 0.02b 3.04 ± 0.10bc 42.43 ± 0.71b 3.93 ± 0.15b Cu+MT（400 μmol/L） 0.37 ± 0.02c 2.79 ± 0.05d 37.43 ± 0.65c 3.77 ± 0.06b F 77.610 52.187 174.498 32.409 P 0.000 0.000 0.002 0.000

2.4 不同浓度MT 浸种对Cu 胁迫下远志幼苗MDA含量及类黄酮代谢的影响

与单一的Cu 胁迫相比，MT 浸种能够不同程度降低Cu 胁迫下远志幼苗的MDA 含量并增加类黄酮含量及其合成关键酶的活性，MDA 含量随着MT 浓度的增加呈先降低后升高趋势，而类黄酮含量及PAL、C4H、4CL 活性均随着MT 浓度的增加呈先升高后降低趋势，当MT 浸种浓度为100 μmol/L 时，MDA 含量较单一的Cu 胁迫明显降低了39.30%（P＜0.05），降幅最大；而类黄酮含量及PAL、C4H、4CL 活性较单一的Cu 胁迫分别明显增加了28.10%、32.01%、40.81%、85.78%（P＜0.05），增幅最大，见表4。

表4 不同浓度MT 浸种对Cu 胁迫下远志幼苗MDA 含量及类黄酮代谢的影响（±s，n = 3）Tab. 4 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on MDA contents and flavonoids metabolism of Polygala tenuifolia under Cu stress （±s，n = 3）

表4 不同浓度MT 浸种对Cu 胁迫下远志幼苗MDA 含量及类黄酮代谢的影响（±s，n = 3）Tab. 4 Effects of seed soaking with different concentrations of MT on MDA contents and flavonoids metabolism of Polygala tenuifolia under Cu stress （±s，n = 3）

处理 MDA /（μmol/g） 类黄酮 / （mg/g） PAL / （U/g） C4H /（U/g） 4CL / （U/g）CK 2.25 ± 0.12g 4.17 ± 0.25e 0.12 ± 0.01f 0.22 ± 0.01e 0.63 ± 0.04f Cu 5.85 ± 0.17a 6.33 ± 0.23d 0.28 ± 0.01e 0.33 ± 0.01d 0.88 ± 0.04e Cu+MT（5 μmol/L） 5.42 ± 0.08b 6.53 ± 0.36cd 0.29 ± 0.01de 0.35 ± 0.01d 0.94 ± 0.05e Cu+MT（25 μmol/L） 4.93 ± 0.07c 6.99 ± 0.21bc 0.31 ± 0.01c 0.38 ± 0.02c 1.24 ± 0.05c Cu+MT（50 μmol/L） 4.22 ± 0.11d 7.18 ± 0.33b 0.34 ± 0.01b 0.44 ± 0.01b 1.43 ± 0.05b Cu+MT（100 μmol/L） 3.55 ± 0.10f 8.11 ± 0.21a 0.37 ± 0.01a 0.47 ± 0.01a 1.63 ± 0.03a Cu+MT（200 μmol/L） 3.77 ± 0.11e 7.68 ± 0.23a 0.34 ± 0.01b 0.43 ± 0.01b 1.33 ± 0.03c Cu+MT（400 μmol/L） 4.37 ± 0.15d 6.75 ± 0.29bcd 0.30 ± 0.01cd 0.40 ± 0.01c 1.08 ± 0.10d F 280.877 58.259 178.542 138.101 110.167 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

种子萌发期和幼苗生长期是植物生长周期中最为关键的两个阶段，也是对重金属Cu 等非生物逆境胁迫较为敏感的时期，其生长发育的好坏直接关系到最终药材质量的优劣[9]。张鹤山等[10]研究发现Cu胁迫对白三叶种子萌发和根系生长存在“低促高抑”效应，即低浓度Cu 促进种子萌发及根系生长，而高浓度Cu 抑制种子萌发及根系生长。本试验也得到类似结果，Cu 胁迫浓度为5 mg/L 时远志种子发芽率、苗高、根长、鲜重及干重较CK 均增加，Cu 胁迫浓度超过5 mg/L 时明显抑制了种子萌发及幼苗生长。MT 浸种能够不同程度减轻Cu 胁迫对远志种子萌发和幼苗生长的伤害，并以100 μmol/L MT 的缓解效果最佳，这与刘仕翔等[11]在水稻方面和李冬等[12]在豌豆方面的研究结果相似。

重金属胁迫能够破坏植物体内的抗氧化系统平衡而生成过量的活性氧，从而引发细胞膜脂过氧化，膜脂过氧化产生的MDA 含量越高表示细胞膜受损伤越严重[13]。类黄酮是植物体内主要的次生代谢产物，本身具有较强的抗氧化活性，能够捕捉细胞内的活性氧，减轻氧化损伤[14]；PAL、C4H 和4CL 是类黄酮合成途径的3 个关键酶，活性均受光、水分、温度、重金属等环境因素的影响[8]。本试验中，Cu 胁迫下远志幼苗MDA 含量、类黄酮含量及其合成途径3 个关键酶活性均明显提升；100 μmol/L MT 浸种能够进一步明显提高Cu 胁迫下远志幼苗的类黄酮含量及其合成途径3 个关键酶的活性，而明显降低MDA 含量，说明MT 浸种能够通过正调控Cu 胁迫下PAL、C4H和4CL 的活性促进幼苗体内黄酮类化合物的含量，从而提升幼苗的抗氧化能力。

4 结论

外源适宜浓度（100 μmol/L）MT 浸种能够通过正调控类黄酮含量来维持细胞膜结构的稳定性，进而提升远志种子和幼苗对Cu 胁迫的耐受性。因此，MT 浸种能够作为一种有效手段用于缓解远志幼苗培育过程面临的Cu 胁迫问题。但植物抗逆机能的实现是一个十分复杂的生化反应过程，由于本试验所测定的指标有限，MT 增强远志耐Cu 胁迫的深层机理有待通过组学联用技术深入研究。