三种抗肿瘤药物对MCF-7 乳腺癌干细胞作用的初步研究

邬 俊，陈 毅，王 贵，李 双，姜 爽，王晓波

(1.大连医科大学 药学院，辽宁 大连 116044；2.中国人民解放军联勤保障部队第967 医院 药剂科，辽宁 大连 116021）

乳腺癌是全球女性癌症相关死亡最常见的主要原因之一。尽管近年来其在诊断和治疗策略方面取得了进展，但处于缓解期的患者仍可能出现复发和转移，这常导致乳腺癌患者传统治疗的失败[1]。肿瘤干细胞，也称为肿瘤起始细胞，是肿瘤中未分化细胞的一个小而重要的亚群，能够自我更新并分化为导致肿瘤形成和随后转移的不同细胞类型，且其具有高侵袭、转移能力以及复杂的耐药机制，这些特殊性使其成为抗肿瘤药物研发的重点和难点[2]。早在2003 年，ALHAJJ M 等[3]首次从乳腺肿块中分离出少量抗原表型为CD44+/CD24-/low 的乳腺癌干细胞（BCSCs），并进一步发现具有CD44+/CD24-/low 表面标记的细胞对干细胞样细胞存在高度富集。随着研究的进一步深入，越来越多的证据证实BCSCs 是导致乳腺癌进展、转移和对常规治疗产生抵抗的重要驱动力[4-5]。因此，如何分离并鉴定这一细胞亚群以及发现对其具有抑制作用的药物对乳腺癌治疗至关重要[6-7]。本研究采用无血清培养法培养乳腺癌MCF-7 细胞系中的BCSCs，并考察CD44+/CD24-细胞亚群比例、自我更新、生长增殖、迁移侵袭以及耐药能力，从而加深对BCSCs 的认识，并探索三种传统抗肿瘤药物阿霉素、5-氟尿嘧啶及纳米雄黄对BCSCs 的作用，以期为今后预防乳腺癌复发和转移等相关治疗及疗效评价提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 仪器与试药

BNP-150CDF1 型CO2细胞培养箱（苏州贝茵医疗器械有限公司）；Olympus IX73 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；TD4K-Z 型低速离心机（长沙东旺实验仪器实验有限公司）；C6 型流式细胞仪（美国BD 公司）；Anthos 2010 型全自动酶标仪（英国Biochrom Anthos 公司）。

RPMI1640（批号：8120417）、DMEM-F12（批号：81162041）培养基、胎牛血清FBS（批号：1891605）和B27 添加剂（批号：2234247），均购自美国Gibco 公司；胰蛋白酶（批号：907G048）、DAPI 染色剂（批号：20180105）、结晶紫染液（批号：1019B041）、青霉素和链霉素（批号：20200928），均购自北京索莱宝科技有限公司；人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，批号：03319303362）、人表皮生长因子（EGF，批号：03316783542），购自北京Novoprotein 公司；人工基底膜Matrigel（批号：0013012，美国BD 公司）；CD44-FITC 单克隆抗体（批号：B277911）、CD24-PE 单克隆抗体（批号：B273848）及FITC（批号：B265825）、PE 同行对照（批号：B302650）、CCK-8 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（批号：71011500），购自美国Biolegend公司）；阿霉素（批号：2468183）、5-氟尿嘧啶（批号：WXBC0190V），购自美国Sigma Aldrich 公司；雄黄（原料药，湖北中药研究所，纯度98%，批号：140408，并按照文献[8]方法制备纳米雄黄）。

1.2 细胞

人乳腺癌MCF-7细胞株，购自中国科学院细胞库。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 有血清培养：MCF-7 乳腺癌细胞按1 × 105/mL 细胞密度培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI1640 培养液（SSM）中，培养于37℃、5%CO2、100%湿度的恒温细胞培养箱中，倒置显微镜下观察细胞状态，待细胞铺满培养瓶底面80% ～ 90%时，用含0.04% EDTA 和0.25%胰酶的消化液进行消化并传代；无血清培养：取对数期的MCF-7 细胞，用含20 ng/mL 的bFGF、20 ng/mL EGF、2% B27、1%青链霉素的DMEM-F12 培养液（SFM）重悬，按5 × 104/mL 细胞密度接种于低吸附6 孔板中，置于细胞培养箱培养，3 d 进行半量换液，待细胞增殖为致密的悬浮微球体时，机械吹打成单细胞悬液，每7 d 传代一次。

1.3.2 荧光显微镜检测MCF-7 亲本细胞及其悬浮球干细胞CD44 和CD24 表达情况 取对数期MCF-7 亲本细胞及第3 代悬浮球干细胞，制成单细胞悬液，收集1 × 106个细胞于离心管中，离心，用PBS 冲洗细胞3 次，最后将细胞重悬于100 µLPBS中，随后分别加入5 µL CD24-PE 和CD44-FITC，混匀避光置于4℃冰箱30 min。PBS 冲洗细胞3 次，按说明书加入细胞悬液3 倍体积的核染色剂DAPI 染色15 min 进行细胞定位，PBS 冲洗3 次，取10 µL 滴于载玻片上，置于荧光显微镜下观察，实验重复3 次。1.3.3 流式细胞仪检测MCF-7 亲本细胞及其悬浮球干细胞CD44 和CD24 表达情况 细胞收集方法同“1.3.2”项，分别收集5 × 106个细胞于离心管中，PBS 冲洗细胞3 次，随后将细胞重悬于500 µLPBS，混匀，将两种细胞悬液按以下方式各分为5 组，加入相对应抗体各5 µL：空白对照组（只含细胞）、IgG2b-FITC + IgG2a-PE 同型对照组、CD44-FITC单染组、CD24-PE 单染组、CD44-FITC + CD24-PE双染组。避光置于4 ℃冰箱30 min。PBS 冲洗细胞3次，重悬于100 µLPBS 中，1 h 内用流式细胞仪检测，实验重复3 次。

1.3.4 流式细胞仪检测悬浮球干细胞培养中CD44+/CD24-亚群比例变化情况 分别取培养至第7、14、21、28、35、42 天处于对数期的悬浮球干细胞，制成单细胞悬液，分别收集1 × 106个细胞于离心管中，PBS 冲洗3 次，将细胞重悬于100 µL PBS 中，分别加入5 µL CD24-PE 和CD44-FITC，混匀并避光置于4℃冰箱30 min。PBS 冲洗细胞3 次，重悬于100 µLPBS 中，1h 内用流式细胞仪检测CD44+/CD24-细胞亚群比例，实验重复3 次。

1.3.5 SSM 条件下检测悬浮球干细胞分化情况取第5 代对数期悬浮球干细胞于离心管中，收集悬浮球，将其重悬于SSM 中培养。每2 d 换一次液，在倒置显微镜下对细胞形态进行观察，每3 d 传代1 次，培养至第3、6 天后收集1 × 106个细胞进行CD44-FITC 和CD24-PE 双染，步骤同“1.3.4”项，1 h 内上机检测CD44+/CD24-细胞亚群比例，并取分化3 d后的贴壁细胞重悬于SFM 中，按5 × 104/mL 细胞密度接种于低吸附6 孔板中，观察细胞形态，每7 d 传代1 次，并于3、35、42 d 后检测CD44+/CD24-细胞亚群比例，实验重复3 次。

1.3.6 CCK-8 检测细胞增殖情况 取对数期MCF-7 亲本细胞和第5 代悬浮球干细胞，按2 × 103个/孔接种至96 孔板中，亲本细胞用SSM 培养，悬浮球干细胞分别用SSM 和SFM 培养，并以单一培养基组作为空白组，每组设置3 个复孔，置于细胞培养箱中进行培养。于培养第1、3、5、7、9 天，添加CCK-8 试剂，置于细胞培养箱孵育4 h，用酶标仪检测各组细胞450 nm 溶液吸光度（A），并以培养天数为横坐标，各组吸光度平均数为纵坐标，绘制细胞生长曲线，实验重复3 次。

1.3.7 划痕实验检测细胞迁移情况 取对数期MCF-7 亲本细胞及第5 代悬浮球干细胞，制成单细胞悬液，重悬于SSM 中，以1 × 105个/孔接种至24孔板中，每组设置3 个复孔，置于细胞培养箱中，待细胞铺满孔底后，用10 µL 的枪头垂直于横线进行划痕，PBS 冲洗2 次，加入无血清RPMI1640 培养基，置于细胞培养箱培养，于培养第0、24、48 天于倒置显微镜下观察伤口愈合情况，对各组进行拍照记录并分析，划痕愈合率（%）= 1 ～ 24 h 或48 h划痕宽度/0 h 划痕宽度×100%，计算细胞划痕愈合率。划痕愈合率越高代表细胞迁移能力越强，实验重复3 次。

1.3.8 Transwell 检测细胞的侵袭情况 将Matrigel胶按照1 ∶8 的比例与预冷的DMEM/F12 混匀后，向Transwell 小室中每孔加入50 µL 基质胶，摇晃使其均匀铺满小室底膜，放入37℃细胞培养箱中孵育4 h。取对数期MCF-7 亲本细胞及第5 代悬浮球干细胞，分别制备成单细胞悬液，PBS 冲洗细胞1 次，将其重悬于无血清RPMI 1640 培养基中。取1 × 105个细胞均匀接种至小室内，小室外加入700 µL SSM，并设置一组不加细胞的小室为空白孔，每组设置3 个复孔。培养24 h 后取出小室，PBS 漂洗2 次，将小室放入3.7%甲醛中固定5 min，100%的甲醇中固定20 min，PBS 漂洗2 次，随后将小室放入0.1%结晶紫乙醇溶液中染色15 min，PBS 漂洗2 次，用棉棒轻轻擦去微孔膜上层细胞，晾干，倒置显微镜下观察小室膜下层细胞并拍照。随后将各组小室放入加有400 µL 33%的乙酸的24 孔板中，使细胞上的结晶紫全部溶解于乙酸中，最后将溶解了结晶紫的乙酸溶液移入96 孔板中，用酶标仪检测其在570 nm 下的吸光度。溶液的吸光度越大反应穿过膜的数量越多，细胞的侵袭能力越强，实验重复3 次。

1.3.9 CCK-8 法检测三种抗肿瘤药物对细胞生长增殖能力影响 取对数期MCF-7 亲本细胞和第5 代悬浮球干细胞，亲本细胞用SSM 培养，悬浮球干细胞分别用SSM 和SFM 培养，按5 × 103个/孔接种至96 孔板中，每孔加入细胞液体积90 µL，12 h 后分别加入浓度为25、50、100、200、400 µg/mL 的抗肿瘤药物阿霉素和5-氟尿嘧啶及纳米雄黄混悬液10 µL，同时设置空白对照组，每组设3 个复孔，培养24 h 后加入10 µL CCK-8，置于细胞培养箱中培养4 h 后用酶标仪检测其在450 nm 处的吸光度（A），由增殖抑制率（%）= 1 -A实验组/A空白组× 100%，计算各组细胞增殖抑制率。并以药物浓度为横坐标，抑制率平均值为纵坐标绘制曲线，实验重复3 次。

1.3.10 流式细胞仪检测三种抗肿瘤药对乳腺癌干细胞CD44+/CD24-亚群比例的影响 取对数期第5 代悬浮球干细胞，并制成单细胞悬液，以每孔5 × 105的细胞密度铺于低吸附6 孔板，12 h 后加药处理，将细胞随机分为空白组、阿霉素（2.5、10 µg/mL）组、5-氟尿嘧啶（2.5、10 µg/mL）组、纳米雄黄（2.5、10 µg/mL）组，每组设置3 个复孔，继续培养48 h 后，收集处理后悬浮球干细胞，实验步骤同“1.3.4”，1 h 内用流式细胞仪检测CD44+/CD24-细胞亚群比例，实验重复3 次。

1.3.11 统计学方法 用SPSS 22.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 MCF-7 亲本细胞及其悬浮球干细胞形态观察

SSM 条件下，MCF-7 亲本细胞呈类似多边形进行单层贴壁生长；在SFM 条件下，少数细胞悬浮于培养基中，24 h 后形成由几个细胞聚集而成悬浮球，细胞间连接松散；3 ～ 7 d 后，悬浮球体积逐渐增大，数目增多，球内细胞结合紧密，折光性强。7 d 后将悬浮球机械吹打制成单细胞悬液并进行传代，发现细胞可继续呈悬浮球状生长。该结果表明在SFM 条件下，部分MCF-7 细胞能存活并增殖形成具有自我更新能力的悬浮细胞球，见图1。

图1 有血清和无血清培养条件下MCF-7 乳腺癌细胞形态观察显微图Fig. 1 Micrograph of cell morphology of MCF-7 breast cancer cell in serum and serum-free culture

2.2 荧光显微镜下观察CD44 和CD24 表达情况

在倒置荧光显微镜下，CD44-FITC 表达呈绿色，对比MCF-7 亲本细胞和悬浮球干细胞在CD44 上的表达，发现两者都呈高度表达；CD24-PE 表达呈红色，对比两者在CD24 上的表达，发现亲本细胞高度表达CD24，而悬浮球干细胞低表达CD24，见图2。

图2 荧光显微镜下MCF-7 亲本细胞及其悬浮球干细胞CD44、CD24表达情况Fig. 2 The expression of CD44 and CD24 in MCF-7 parental cells and their suspension stem cells observed under fluorescence microscope

2.3 流式细胞仪检测CD44 和CD24 的表达情况

单染组流式细胞仪检测结果表明，MCF-7 亲本细胞和悬浮球干细胞都高表达CD44，两者差异无统计学意义（P＞ 0.05）；而其在CD24 表达上有差异（P＜0.05），亲本细胞高表达CD24，而悬浮球干细胞对CD24 呈低表达状态，这与免疫荧光实验结果一致；双染组流式结果进一步表明，亲本细胞中主要是CD44+/CD24+细胞亚群，而悬浮球干细胞主要是CD44+/CD24-细胞亚群，即SFM 条件下可以有效富集BCSCs，见图3。

图3 流式细胞仪检测MCF-7 亲本细胞及其悬浮球干细胞CD44 和CD24表达情况Fig. 3 The expression of CD44 and CD24 in MCF-7 parental cells and their suspension stem cells detected by flow cytometry

2.4 悬浮球干细胞培养中CD44+/CD24-细胞亚群比例变化情况

与培养第1 代悬浮球干细胞相比，随着培养代数的增加，CD44+/CD24-细胞亚群比例增加，且当培养至第5 代时该比例达到最高，表明第5 代悬浮球能高效富集BCSCs，所以在后续实验中均采用第5 代悬浮球干细胞作为BCSCs 进行实验，见图4。

图4 流式细胞仪检测悬浮球干细胞培养中 CD44+/CD24-细胞亚群的变化情况Fig. 4 Changes of CD44+/CD24- cell subsets in suspension stem cell culture detected by flow cytometry

2.5 SSM 条件下悬浮球干细胞分化情况

将所形成的悬浮球重悬于SSM 中，倒置显微镜下观察发现：6 h 后少数单个的悬浮球干细胞开始贴壁；24 h 后可见贴壁细胞增多，其形态类似多边形，其中体积大的悬浮球边缘细胞开始贴壁；36 h 后大部分细胞从悬浮球团中迁移出来，与已贴壁的细胞进行融合；72 h 后大部分细胞球形态消失，细胞呈贴壁生长，其细胞形态与MCF-7 亲本细胞无明显差异，表明悬浮球干细胞具有一定的分化能力，见图5。

图5 显微镜下观察SSM 条件下MCF-7 悬浮球干细胞的分化能力Fig. 5 Differentiation ability of MCF-7 suspension cells in SSM under microscope

收集分化3、6 d 后贴壁细胞进行检测，结果表明与分化前的悬浮球干细胞相比，分化后CD44+/CD24-亚群细胞比例明显下降，培养第6 天后，该CD44+/CD24-亚群细胞比例与亲本细胞比较，两者差异无统计学意义（P＞ 0.05），将分化后3 d 后的贴壁细胞重悬于SFM 条件下培养，发现3 d 后该比例有所上升，继续培养至第5 代，该比例达到最高，该结果进一步表明悬浮球干细胞具有一定的自我更新能力，见图6。

图6 MCF-7 悬浮球干细胞诱导分化、SFM 条件下重悬后，细胞形态及CD44+/CD24-细胞亚群比例变化Fig.6 Changes of cell morphology and the proportion of CD44+/CD24-cell subsets after MCF-7 suspension cells were induced to differentiate and resuspended under SFM conditions

2.6 MCF-7 悬浮球干细胞的增殖能力

比较三组细胞的生长曲线，可以看出培养第1 天时细胞含量比较相似，但随着培养时间的增加，MCF-7 悬浮球分化细胞增殖速度比悬浮球干细胞快，悬浮球干细胞增殖速度比亲本细胞快，即MCF-7 悬浮球干细胞在SFM 及SSM 条件下，较亲本细胞具有更强的增殖能力，自培养第2 天后结果有差异（P＜0.05），见图7。

图7 MCF-7 悬浮球干细胞、悬浮球分化细胞及其亲本细胞生长增殖能力比较Fig. 7 Comparison of cell growth and proliferation ability of MCF-7 breast cancer mammosphere cells, differentiated cells and their parental cells

2.7 MCF-7 悬浮球干细胞的迁移能力

与亲本细胞组相比，相同条件下MCF-7 悬浮干细胞组的划痕愈合率更大，表明悬浮球干细胞具有更强的迁移能力（P＜0.05），见图8。

图8 MCF-7 悬浮球干细胞和亲本细胞迁移能力比较（x ± s，n = 3）Fig. 8 Comparison of migration ability between MCF-7 suspension stem cells and parent cells（x ± s，n = 3）

2.8 MCF-7 悬浮球干细胞侵袭能力

与MCF-7 亲本细胞组相比，相同条件下悬浮球干细胞组吸光度值更大（P＜0.05），即穿过基底膜的细胞数更多，悬浮球干细胞具有更强的侵袭能力，见图9。

图9 MCF-7 悬浮球干细胞和亲本细胞侵袭能力比较（x ± s，n = 3）Fig. 9 Comparison of invasive ability between MCF-7 suspension stem cells and parental cells（x ± s，n = 3）

2.9 三种传统抗肿瘤药对MCF-7 乳腺癌亲本细胞、分化细胞、悬浮球干细胞的抑制作用

将传统抗肿瘤药阿霉素、5-氟尿嘧啶以及纳米雄黄（2.5、5、10、20、40 µg/mL）同时作用于MCF-7亲本细胞、悬浮球分化细胞及悬浮球干细胞24 h 后，结果随着药物浓度的增加，其对细胞的抑制率也增加，计算三种药物对于三种细胞的IC50值，对比不同药物对相同细胞的作用，发现其对细胞的抑制作用顺序为阿霉素＞纳米雄黄＞5-氟尿嘧啶，见图10；对比相同药物对不同细胞的作用，发现同一药物对悬浮球干细胞IC50＞悬浮球分化细胞IC50＞亲本细胞IC50，见图11，即在SSM 及SFM 条件下，相比于亲本细胞，悬浮球干细胞具有更强的耐药性（P＜0.05）。根据三种药物对悬浮球干细胞的IC50，选取2.5、10 µg/mL 作为给药浓度，研究三种药物对乳腺癌干细胞CD44+/CD24-细胞亚群比例的影响。

图10 三种抗肿瘤药物对MCF-7 亲本细胞、悬浮球分化细胞以及悬浮球干细胞的抑制作用比较（x ± s，n = 3）Fig. 10 Comparison of inhibitory effects of three antitumor drugs on MCF-7 parent cells, suspension ball differentiated cells and suspension stem cells（x ± s，n = 3）

图11 三种抗肿瘤药物对MCF-7 亲本细胞、悬浮球分化细胞以及悬浮球干细胞的IC50 值比较Fig. 11 Comparison of the value of IC50 of three antitumor drugs on MCF-7 parent cells、suspension ball differentiated cells and suspension stem cells

2.10 三种抗肿瘤药对乳腺癌干细胞CD44+/CD24-亚群比例的影响

与空白组相比，不同浓度的阿霉素、5-氟尿嘧啶、纳米雄黄处理48 h 后，随着药物浓度的增加，悬浮球干细胞CD44+/CD24-细胞亚群比例明显降低，低浓度时，阿霉素组的作用更突出（P＜0.05）；高浓度时，纳米雄黄组的作用更突出（P＜0.05），表明高浓度组的纳米雄黄可有效抑制乳腺癌干细胞，见图12。

图12 三种抗肿瘤药物对悬浮球干细胞CD44+/CD24-亚群比例的影响Fig. 12 Effect of three antitumor drugs on the proportion of CD44+/CD24-cell subsets of suspension stem cells

3 讨论

目前，CSCs 主要通过细胞表面标志物的高表达或其功能方面的性质进行识别和分离，最常用的分离方法是基于特定的细胞表面生物标志物或生物标志物组合。其它常用的方法包括利用CSCs 高表达ATP-结合盒转运蛋白、高表达ALDH1 以及其强大的自我更新和增殖等内在特性的侧群细胞分离法、ALDEFLUOR 测定法以及无血清悬浮球培养法。这些方法已广泛应用于从癌细胞系和不同肿瘤组织（包括乳腺癌）中分离 CSCs，且研究证明从上述四种方法中分离的 BCSCs 在体内具有形成异质肿瘤的能力[9]。

本研究采用的无血清培养法能有效富集MCF-7细胞系中的BCSCs，且随着培养时间的增加，CD44+/CD24-比例呈上升趋势；研究发现在SSM、SFM 条件下BCSCs 较亲本细胞具有更强的增殖能力，其中分化细胞的增殖能力强于悬浮球干细胞，这可能是由于血清对细胞增殖的促进作用；同时研究还发现在SSM 以及SFM 条件下BCSCs 较亲本细胞具有更强的耐药性，且BCSCs 耐药性强于分化细胞，这可能是由于诱导分化显著降低CD44+/CD24-BCSCs 比例所致。目前临床上治疗乳腺癌常采用化疗药物如阿霉素、5-氟尿嘧啶、紫杉醇等，但其毒副作用较大，常联合中药进行治疗以增效减毒。

近年来随着对中药抗肿瘤作用的研究，发现丹参酮、柴胡皂苷D、散沫花素等中药成分能有效抑制乳腺癌细胞的生长增殖[10-11]，纳米雄黄作为一种传统中药，研究发现能有效抑制肺癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞，并对白血病干细胞、肺癌干细胞表现出良好的抑制作用[12-13]，本研究发现其能有效降低乳腺癌干细胞比例，提示纳米雄黄可能是抑制乳腺癌有效药物之一，这为临床研制有效的抗乳腺癌的药物带来了更多的可能性。本研究对BCSCs 的鉴定仅基于BCSCs 最典型的表面标志物CD44 和CD24，近年来还发现了ALDH1、ABCG2、CD133、CD49f 等标志物[14-15]。本研究对纳米雄黄对乳腺癌MCF-7 细胞及其BCSCs 的作用进行了初步的研究，其对BCSCs 侵袭转移、悬浮球形成以及分化能力的影响以及其对BCSCs 分子水平的作用需要进一步探讨，为未来研制纳米雄黄抗乳腺癌药物提供更多理论依据。

4 结论

本研究发现无血清悬浮培养法可有效富集CD44+/CD24-BCSCs，该方法成本较低、 操作简单、能快速、有效地获得BCSCs，且对BCSCs 性质进行鉴定，发现其具有强大的自我更新、生长增殖、侵袭转移能力以及耐药性，这可能是导致乳腺癌容易复发和转移的原因之一，并进一步发现纳米雄黄可有效抑制乳腺癌MCF-7 细胞生长增殖能力及降低CD44+/CD24-BCSCs 比例。对BCSCs 分离方法的探索、性质的认识以及发现有效抑制BCSCs 的中药成分有助于针对BCSCs 靶向治疗的发展，为临床治疗乳腺癌提供一定的实验基础。