广东地区结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因变异特征

孟繁荣 雷杰 牛群 王楠 吴玲 杨瑜 谢贝 李华 高俊文 傅红梅 刘志辉

1广州市胸科医院肺部疾病研究所（广州 510095）；2广州市胸科医院结核内科（广州 510095）

利福平是目前临床用于抗结核治疗的重要一线药物，在结核病超短程化疗［1］与潜伏性感染的预防性治疗中［2］也具有至为关键的作用。研究［3-4］表明90%左右的利福平耐药结核为耐多药结核病，对利福平的耐药性判定成为临床制定结核病化疗方案和进行预后评估的关键因素。已有研究［4-6］证实约95%的结核分枝杆菌对利福平耐药是由于其rpoB 基因突变所致，且多为507-533 位点的利福平耐药决定区（rifampin resistance-determining region，RRDR）突变，目前检测利福平药物敏感性的分子生物学方法多以此区域的特定突变位点作为靶标。然而因为选择压力、遗传背景或耐药背景等因素的影响，不同地区流行的结核分枝杆菌菌株在变异类型、发生频率与分布特征等方面具有差异。现有分子诊断学方法依靠rpoB 基因几个特定位点作靶标，难以尽数诊断利福平耐药结核病。因此，本文选取广东地区分枝杆菌菌种保藏库中具有不同耐药表型的结核分枝杆菌临床分离株，研究rpoB 基因变异的分子特征，为新型诊断技术的研发和结核病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源373 株结核分枝杆菌临床分离株来源于广东地区分枝杆菌菌种保藏库的保存菌株，包括107 株对4 种一线抗结核药物异烟肼（H）、利福平（R）、乙胺丁醇（E）、链霉素（S）全敏感的菌株（Q 株），95 株R 敏感H 耐药株（RSHR 株），32 株R 耐药H 敏感株（RRHS 株）和139 株耐HR 株（MDR 株）。

1.2 试剂与仪器通用基因组DNA 提取试剂盒（上海生物工程有限公司），溶菌酶（上海生物工程有限公司），米氏7H10 培养基（美国BD 公司），DR001B PCR 扩增试剂盒（TaKaRa 生物技术有限公司），琼脂糖凝胶（Agorose BIO BASIC 有限公司），Gold View NucleicAcid Stain（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），100 bp DNA Ladder（TaKaRa 生物技术有限公司），C1000TM Thermal Cycler PCR 扩增仪（美国BIO-RAD公司），AllegraTM 64R 型高速冷冻离心机（美国贝克曼公司），DNA水平电泳仪（美国BIO-RAD 公司），Gel DocTM XR+ ImagineSystem 凝胶成像仪（美国BIO-RAD 公司），Nano Drop one 超微量紫外分光光度计（美国Thermo fisher 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 PCR 扩增引物以结核分枝杆菌H37Rv 标准株rpoB 基因序列为参考，设计包含rpoB 基因利福平耐药决定区（RRDR）在内的产物长度约333 bp的扩增引物，分别为：上游5'-CGTACGGTCGGCGAGCTGATC-3'，下游5'-AGGGGTTTCGATCGGGCACATC-3'。由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.3.2 PCR 扩增PCR 反应总体积为50 μL，包括TaKaRa Taq（5 U/μL）0.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，DNA 模板1 μL，上下游引物各2 μL，灭菌蒸馏水35.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s～1 min，循环30 次；最后72 ℃延伸7 min。PCR 产物各取4 μL 经1%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪观察结果。

1.3.3 DNA 序列测定与分析经琼脂糖凝胶电泳检测后合格的PCR 产物交由北京六合华大基因科技有限公司进行测序。后利用DNAMAN、CHORMAS 及DNASTAR 软件，将测序结果与结核分枝杆菌H37Rv 标准序列进行比对。

1.4 统计学方法以Excel 表格公式计算各突变类型出现的频率，以SPSS 26.0 进行χ2检验，分析不同耐药表型间rpoB 基因突变率的差异以及不同耐药表型间单位点与双位点变异出现频率的差异。

2 结果

2.1 结核分枝杆菌rpoB基因变异总体特征373株结核分枝杆菌临床分离株样本中，192 株检测到rpoB 基因变异，共发生225 个变异40 种突变种类，其中221 个变异为氨基酸编码位点的碱基置换突变，占比98.22%（221/225），尤以531、526、511、516、533、515 位点突变最为常见，占比分别为43.11%（97/225）、20.89%（47/225）、10.22%（23/225）、8%（18/225）、4.44%（10/225）、4%（9/225）。碱基缺失与碱基插入变异则分别占比1.33%、0.44%。225个变异中，97.78%（220/225）发生在利福平耐药决定区（RRDR）。见表1。

表1 192 株结核分枝杆菌rpoB 基因变异株的基因变化总特征Tab.1 192 Total Changes of rpoB Gene Variable Strain

2.2 结核分枝杆菌rpoB基因变异分布特征192例rpoB 突变株中，159 株仅发生单位点突变，33 株发生双位点突变，其中D516V（13/44）、H526L（6/44）、H526D（5/44）、H526R（5/44）、S531W（6/44）等14 种突变种类只在单位点突变中出现，为单位点特有变异，M515T（5/37）、H526Q（5/37）、D516G（3/37）、M515V（3/37）、E541A（3/37）等21 种突变种类只在双位点突变中出现，为双位点特有变异，S531L（90/144）、L511P（21/144）、H526Y（18/144）、L533P（10/144）、H526N（5/144）为单双位点共有变异，不存在3 个位点的同时变异。见表2。

表2 192 株结核分枝杆菌rpoB 基因变异株基因变化特点分析Tab.2 Gene variation characteristics of 192 Mycobacterium tuberculosis rpoB gene variants

2.3 结核分枝杆菌不同耐药表型rpoB 基因突变情况Q 株、RSHR株、RRHS株和MDR 株的rpoB 基因突变率分别为4.67%（5/107）、28.42%（27/95）、90.62（29/32）、94.24%（131/139），除RRHS株与MDR 株间突变率不具统计学差异外（P＞0.05），Q株/RSHR株、Q 株/RRHS株、Q 株/MDR 株、RSHR株/RRHS株、RSHR株/MDR 株间rpoB 基因突变率具有统计学差异（均P＜0.001）。不同耐药表型间单位点与双位点突变的变异出现频率不具有统计学差异（P＞0.05）。见表3。

表3 不同耐药表型结核分枝杆菌rpoB 基因突变情况Tab.3 rpoB gene mutation of Mycobacterium tuberculosis with different drug resistance phenotypes

3 讨论

利福平耐药已成为初步判定耐多药结核的重要标志［7-9］，超过90%的利福平耐药菌株存在rpoB基因突变［5-7］。在我们的研究中，96.89%的变异发生在rpoB 基因RRDR 区，最常见的531 位点突变率43.11%，低于巴西（61.8%）［10］、印度（59.4%）［11］、刚果（53.1%）［12］、埃塞俄比亚（64.1%）［13］等其他结核病高负担国家以及我国大部分地区［14-17］；其次为526（20.89%）位点，突变率略高于我国江西（16.56%）［14］、河北（15.45%）［15］、江苏（18.3%）［18］、北京（16.67%）［19］、徐州（1.74%）［20］等地，低于浙东（29.7%）［21］、吉林（25.1%）［22］、青海（40.0%）［23］、河南（21.5%）［24］、云南（26.7%）［25］等地区。本次研究中突变率排在前3 位的突变位点分别是531、526和511，不同于以往研究报道的531、526、516 位点，且突变率总和仅占rpoB 基因变异的74.22%，低于大量报道的86%左右［26-28］。同时，共检测到40 种类型的rpoB 基因突变，包括碱基置换、缺失与插入突变，发生率分别为98.18%、1.33%和0.44%，碱基缺失与插入突变发生比率高于我国平均水平［16］。说明广东地区结核分枝杆菌rpoB 基因突变分布相对分散，突变种类与分布频度呈现地方特异性。

40 个突变种类中，有22 个突变种类仅在双位点突变中出现，说明rpoB 基因这些位点的突变类型可能不能够独立导致结核分枝杆菌对利福平耐药，它们或是以一种补偿性变异［29］的形式来弥补其他位点突变对结核分枝杆菌造成的适应性下降，或是与其他位点的变异一起构成RNA 聚合酶空间构象的变化从而导致结核杆菌对利福平的耐药，然而具体机制目前尚不明晰。

本研究中，11 株利福平耐药株未检测到rpoB基因变异，我们推测这些菌株可能存在RRDR 之外的基因变异或其他导致利福平耐药的机制［30-31］。MDR 株与RRHS株均有90%以上的rpoB 基因变异，说明具有利福平耐药背景的结核分枝杆菌拥有稳定的rpoB 突变率，亦可说明编码RNA 聚合酶亚基的rpoB 基因突变是导致利福平耐药的主要原因。107 株全敏感菌株中4.67%存在rpoB 突变，与前期关于我国敏感结核杆菌rpoB 基因沉默突变的流行情况的报告相符合［32］。值得注意的是，95 株异烟肼耐药背景的利福平敏感株（RSHR）中，rpoB 基因突变率高达28.42%。究其原因，一方面可能是结核分枝杆菌对异烟肼的耐药从分子水平影响了其rpoB 突变的机制［25］，这些突变可能是异烟肼耐药株从对利福平敏感获得利福平耐药性的一个中间过渡状态；另一方面，rpoB L511P 突变被WHO 认为是与利福平低水平耐药相关的可信度比较低的突变［33］，王少华等人的研究也表明L511P、L533P、D516Y、H526N 位点的突变是导致结核分枝杆菌rpoB 基因型与利福平药敏表型不一致的主要原因［34-35］，而L511P 与L533P 位点突变正是本研究中RSHR 株的主要突变类型。

表4 rpoB 基因各突变种类代码Tab.4 The simple code of rpoB gene mutation type

总而言之，广东地区结核分枝杆菌rpoB 基因变异具有地域性特征，虽然90%以上的突变发生在RRDR 区，但仍不能忽视RRDR 外区域的位点以及其他分子机制在利福平耐药检测中的作用，同时亦应重视不同耐药表型对rpoB 基因突变或利福平耐药产生的影响。