平胃散加味对非酒精性脂肪肝大鼠炎症介质及氧化应激的影响研究

梁金成 谭文惠 谢梅娟 陈茹琴 徐国良

(1 广东省第二人民医院,广州,510000; 2 佛山市中医院高明医院,佛山,528500)

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是一种代谢应激性疾病,其发病率随着人们饮食习惯、生活方式的改变及经济的发展呈不断上升趋势,严重影响人们的生命质量[1-3]。现代医学对于NAFLD的治疗主要集中在改善胰岛素抵抗、降脂、护肝、抗氧化等方面,再加上饮食调养、运动疗法等,但药物治疗尚存在一定的问题,如部分降脂药会损害肝功能或诱发其他不良反应[4-5]。而中医在NAFLD的治疗上存在较大优势,拥有广阔的发展前景,因而受到国内外广大学者的关注[6-8]。本研究探讨平胃散加味对NAFLD大鼠肝细胞凋亡、炎症介质及氧化应激的影响,旨在为治疗NAFLD提供参考。现将实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取48只6周龄无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级健康SD大鼠,体质量(220±20) g,适应性饲养5～7 d,湿度22～25 ℃,湿度50%～60%,自由进食、饮水,自然昼夜交替。大鼠购自广东省医学实验动物中心,许可证号SCXK(粤)2008-0002。动物实验通过广州中医药大学实验动物伦理委员会审查(伦理审批号:20200731001)。

1.1.2 药物 平胃散加味:厚朴6 g、陈皮6 g、苍术6 g、甘草1.5 g、桃仁3 g、黄连3 g、姜黄6 g、丹参3 g、胆南星3 g、法半夏3 g,药材来自于广州致信药业有限公司(批号依次为200901、200502、201001、201202、201102、200801、210101、200902、201207、200601)。药材经冷水浸泡120 min,水煎,分2次,第1次90 min,第2次60 min,取2次水煎液混合并过滤,将其经水浴蒸发浓缩成含生药1.26 g/mL的浓缩药液。

1.1.3 试剂与仪器 谷草转氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)试剂盒(批号:1907211)、丙转氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)试剂盒(批号:1904082)、白细胞介素-2(IL-2)试剂盒(批号:1902071)、白细胞介素-6(IL-6)试剂盒(批号:1908172)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(批号:1905281)购于上海晶抗生物工程有限公司,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒(批号:1907171)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)试剂盒(批号:1910021)购于上海雅吉生物科技有限公司。全自动生化分析仪(日立公司,日本,型号:AQT90);Beckman imark酶标仪(Bio-rad伯乐,美国,型号:1681130A)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将48只大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组和高剂量组,每组12只。除对照组大鼠给予正常饲料外,其余各组大鼠给予OpenSource DietsTM高脂饲料12周制备非酒精性脂肪肝大鼠模型。

1.2.2 给药方法 各组大鼠根据10 mL/kg给药,对照组和模型组大鼠给予等剂量生理盐水灌胃,低剂量大鼠给予1.89 g生药/kg灌胃,高剂量大鼠给予7.56 g生药/kg灌胃,1次/d,连续灌胃8周。

1.2.3 检测指标与方法 于第8周末各组大鼠禁食12 h,称取大鼠体质量,给予戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,于大鼠心脏采血,采集心脏血以4 000×g离心8 min后取血清,放置于-80 ℃下保存待测。将大鼠肝脏组织摘除,称量肝脏湿重。1)肝细胞凋亡观察:采用肝脏指数评价肝细胞凋亡,肝脏指数计算参照相关标准[2],指数越高肝细胞凋亡越明显。2)肝功能水平和氧化应激测定:取上述血清标本,采用全自动生化分析仪测定血清GOT、GPT、MDA和SOD水平,依据试剂盒说明书操作。3)炎症介质测定:取上述血清标本,采用酶联免疫吸附试验法测定IL-2、IL-6和TNF-α水平,依据试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织病理学的影响 对照组大鼠肝脏质地柔软,表面光滑;模型组大鼠肝脏体积增大,质地较韧,光镜下肝细胞呈不规则排列,且存在大量脂肪空白细胞,胆管汇管区有大量炎症细胞浸润;低剂量组和高剂量组肝脏色泽、体积和质地均有改善,脂肪空泡少见,未见大量炎症细胞浸润。见图1。

图1 各组大鼠肝组织病理学改变(HE染色,×200)

2.2 各组大鼠肝脏指数比较 模型组、低剂量组和高剂量组肝脏指数高于对照组(P<0.05);低剂量组和高剂量组肝脏指数低于模型组,且高剂量组低于低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肝脏指数比较

2.3 各组大鼠肝功能比较 模型组、低剂量组和高剂量组血清GOT和GPT水平高于对照组(P<0.05);低剂量组和高剂量组血清GOT和GPT水平低于模型组,且高剂量组低于低剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肝功能比较

2.4 各组大鼠炎症介质比较 模型组、低剂量组和高剂量组血清IL-2、IL-6和TNF-α水平高于对照组(均P<0.05);低剂量组和高剂量组血清IL-2、IL-6和TNF-α水平低于模型组,且高剂量组低于低剂量组(均P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠炎症介质比较

2.5 各组大鼠氧化应激比较 模型组、低剂量组和高剂量组血清MDA水平高于对照组,而SOD水平低于对照组(P<0.05);低剂量组和高剂量组血清MDA水平低于模型组,而SOD水平高于模型组(P<0.05);高剂量组血清MDA水平低于低剂量组,而SOD水平高于低剂量组(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠氧化应激比较

3 讨论

NAFLD是常见的一种慢性肝病,目前认为是与遗传易感和胰岛素抵抗关系紧密的代谢应激性肝脏损伤,而炎症反应和氧化应激在NAFLD发生、发展中具有重要作用[9-12]。中医学中并无脂肪肝相关描述,与之相关的记载可见于《黄帝内经》对肥气的描述。中医学认为,饮食不节、痰湿体质、情志失调、劳逸失度等因素均可导致脾虚湿蕴、痰浊聚肝,进而导致脂肪肝的形成[13-14]。中医理论认为,脾脏功能失调是脂肪肝形成的病理基础,脾主运化,主收纳腐熟水谷、运化精微[15]。《素问·经脉别论篇》曰:“饮于入胃,游溢精气,上输于脾,脾气散精,上归于肺,通调水道,下输膀胱,水精四布,五经并行。”可见,脾在气血津液输布代谢中的重要作用。同时,脾为后天之本,气血生化之源,若脾失健运,则导致水谷精微运化障碍,表现为水肿、眩晕、气血衰少、消瘦等脾虚湿困症状[16-17]。平胃散加味方出自《名医类案正续编》,该方由厚朴、陈皮、苍术、甘草、桃仁、黄连、姜黄、丹参、胆南星、法半夏共同组成。其中厚朴、陈皮、苍术、甘草具有燥湿运脾、行气和胃的功效;黄连具有清热燥湿的功效;胆南星、法半夏具有燥湿化痰的功效;丹参、姜黄具有活血化瘀的功效。纵观全方可奏燥湿运脾、行气和胃、化瘀之功。本研究发现,低剂量组和高剂量组肝脏指数低于模型组,由此可见平胃散加味可缓轻肝细胞凋亡。

GOT和GPT是肝功能的重要评价指标,其中GOT能够判断肝损害程度,而GPT可反映肝脏病理改变程度。本研究发现,低剂量组和高剂量组血清GOT和GPT水平低于模型组,由此可见平胃散加味可明显减轻肝细胞受损和脂肪变程度,能够有效保肝降酶,从而改善肝功能。研究证实,NAFLD与肝脏中炎症介质有关,炎症介质通过刺激肝脏发生炎症反应,诱导肝纤维化并导致肝细胞坏死、凋亡,在NAFLD的发生、发展中具有重要作用[18]。IL-2不仅可促进活化B细胞增殖,且可诱导产生TNF-α等细胞因子[19]。炎症介质IL-6与肝脏局部炎症反应有关,不仅能够抑制脂蛋白脂酶的活性,且可抑制脂肪分解,从而促进脂肪肝形成[20]。炎症介质TNF-α是由于各种原因造成肝脏损伤过程中最早出现的一种细胞因子,不仅参与多种炎症反应和免疫反应,同时还可导致其他细胞因子的释放[21]。SOD作为保护机体免受脂质过氧化损害的一种抗氧化剂,可清除脂质过氧化物和自由基,从而阻断和减轻脂质过氧化作用[22]。MDA作为脂质过氧化的一种最终产物,可引起细胞坏死、肿胀,导致细胞膜结构严重破坏,其水平变化可作为脂质过氧化损伤程度判断的一种指标[23]。

综上所述,平胃散加味可减轻NAFLD大鼠肝细胞凋亡,减轻肝脏炎症反应并调节肝脏氧化应激。但本研究还存在一些不足,纳入大鼠较小,还需增加大鼠数量,深入进行多中心、多样本研究,以提高可靠的参考依据。