益肾骨康方对肺癌A549细胞形态及转录组基因表达的影响

何理玉 杨梦霞 芦殿荣 冯 利

(1 中国中医科学院望京医院,北京,100102; 2 国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院,北京,100021)

肺癌是癌症相关死亡最常见的原因,2018年全世界约有209万人被诊断为肺癌,176万人死于肺癌。我国癌症统计数据显示2015年新发肺癌病例73万例,死亡病例61万例。肺癌患者的5年生存率根据分期和地域差异在4%～17%之间变化[1-2]。肺癌发病率和死亡率随着年龄增长而上升。伴随我国人口老龄化、工业化发展导致的大气和环境污染以及烟草流行率全球最高,我国肺癌发病率和死亡率将会进一步攀升[3-4]。临床上肺癌的治疗采用多学科综合治疗的原则,具体手段包括手术、放疗和化学治疗,以及靶向、免疫、生物治疗等。西医治疗恶性肿瘤占主流地位,但存在瓶颈且尚未突破。中医根据整体观和辨证论治对恶性肿瘤及其并发症的治疗具有独到的见解。益肾骨康方(专利号:ZL2013 1 0582907.9,专利权人:冯利)是冯利教授根据中医理论治疗恶性肿瘤骨转移癌痛研制而成的处方,临床及基础研究验证有效。前期细胞实验研究发现益肾骨康方可以抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移等[5]。本研究拟用益肾骨康方干预,通过电镜观察肿瘤细胞表面形态的改变以及通过转录组基因测序探讨益肾骨康方作用于肺癌A549细胞的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人肺腺癌A549细胞株由中国中医科学院望京医院骨伤科研究所药理室惠赠。

1.1.2 药物 益肾骨康方中药购自中国中医科学院望京医院门诊中药房,中药饮片加水浸泡30 min,煎成60 mg/mL的中药母液,滤网过滤后,用0.22 μm孔径的针筒式微孔滤膜过滤器过滤,混匀,分装,放入-80 ℃冰箱保存备用。使用时将中药母液溶于RPMI1640无血清培养基中配置成4.18 mg/mL中药干预浓度。

1.1.3 试剂与仪器 RPMI1640基础培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素混合溶液、0.25%胰蛋白酶消化液(北京索宝莱科技有限公司,货号分别为10491、11011-8611、P1400、T1300);Trizol(ambion公司,美国,货号:15596026)。TC处理96孔圆形细胞爬片(上海卧宏生物科技有限公司,货号:LY-14-TC)。细胞培养箱(Thermo公司,美国,型号:Forma 370);倒置光学显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司,型号:Motic AE2000);离子溅射仪、扫描电镜(HITACHI公司,日本,型号分别为:E-1010、S-3400N)。

1.2 方法

1.2.1 电镜 将TC处理的96孔圆形细胞爬片(直径3 mm)放置于96孔板。将生长状态良好的A549细胞,消化,离心(1 000 r/min,离心半径13.5 cm),调整细胞悬液浓度为8×104个/mL,接种于带有爬片的96孔板中,待细胞长满爬片80%左右,分2组给药:对照组,即用不含中药的基础培养基培养细胞;益肾骨康方组,即用含中药4.18 mg/mL的基础培养基培养细胞。24 h后,弃去培养液,将爬片放置于24孔板,PBS洗2遍,每孔加入1.5 mL 2.5%戊二醛固定液固定,4 ℃冰箱过夜,磷酸盐缓冲液漂洗3遍,1%OsO4固定45 min,磷酸盐缓冲液漂洗3遍,脱水∶丙酮∶醋酸异戊酯(1∶1)10 min,醋酸异戊酯0.5 h,临界点干燥,离子溅射仪喷金,分别于扫描电镜2.00 k、5.00 k放大倍数下观察、拍照。

1.2.2 转录组基因测序

1.2.2.1 差异基因筛选 该研究分为益肾骨康方组和对照组2组分别干预肺癌A549细胞,24 h后检测mRNA的表达情况。具体操作步骤为RNA提取、检测、mRNA富集、双链cDNA合成、末端修复(加A和接头)、片段选择和PCR扩增、文库检测、Illumina上机测序、数据指控和基因表达水平定量等。使用DESeq2 R软件进行益肾骨康方组和对照组2组之间的差异表达分析(每个组2个生物学重复)。通过DESeq2发现调整的P值<0.05的基因被分配为差异表达的。使用Benjamini&Hochberg方法调整P值。校正后的P值以及|log2foldchange|作为显著差异表达的阈值。

1.2.2.2 差异基因富集分析 通过clusterProfiler R软件实现差异表达基因的基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析,其中修正了基因长度偏差。考虑具有<0.05的校正的P值的GO term通过差异表达基因显著富集。京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)是一个数据库资源,用于从分子水平的信息,特别是基因组测序产生的大规模分子数据集和其他高通量数据库中了解生物系统的高级功能和效用,如细胞,生物体和生态系统等。我们使用clusterProfiler R软件分析KEGG通路中差异表达基因的统计富集。

1.2.2.3 差异基因蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络分析 Cytoscape 3.6.0是一个生物信息学软件平台,用于可视化分子交互网络,通过该软件构建PPI网络图;MCODE(Version 1.4.2,Bader Lab,University of Toronto)是一个能对构建的生物学网络进行关联度分析的插件,根据关联积分值,可获得整个网络中可能形成的蛋白质簇和关键节点蛋白,并在Cytoscape软件中进行可视化显示。选取标准如下:MCODE评分>5,度截止为2,节点分值截止为0.2,k分值等于2。

2 结果

2.1 A549细胞表面的形态变化 A549细胞在正常情况下形态为梭形和多角形。对照组细胞形态正常,饱满,表面有膜皱,丝状伪足。益肾骨康方组可见细胞表面膜皱显著减少,丝状伪足断裂,凋亡小体形成。细胞皱缩和凋亡小体的形成是细胞凋亡的特征。丝状足是一种较薄的细胞质突起,在细胞附着到生长表面、协助细胞迁移等方面起着重要作用,是细胞与细胞连接的重要组成部分。见图1。

图 1A549细胞表面形态变化的扫描电镜观察(×6 000)

2.2 转录组基因测序

2.2.1 差异基因筛选 益肾骨康方组和对照组的基因表达情况,2组比较矫正Pvalue<0.05,|log2FoldChange|>1的差异表达基因有440个,其中下调基因有136个,上调基因有304个,其中与益肾骨康方抑制肿瘤细胞作用关系密切的基因为SOX2,SOX2在益肾骨康方组中表达下调。差异基因火山图见图2。

2.2.2 GO和KEGG富集分析 在GO功能富集过程中共得到307条结果,主要涉及生物过程(237项)、细胞组分(56项)和分子功能(14项)。在生物过程中,主要包括外源性凋亡信号通路、转移酶活性

图2 差异基因火山图

的负调节等;在细胞组分中,主要包括黏着连接、细胞-基质连接、细胞-基质黏附连接等;在分子功能中,主要包括细胞黏附分子结合、钙黏蛋白结合参与细胞黏附、细胞-细胞黏附递质活性等。从GO富集分析结果中,选取最显著的30个Term绘制散点图。见图3。将分析条件设为错误发现率(FDR)<0.05,分别在生物过程、细胞成分和分子功能方面筛选出前10个显著富集的条目。KEGG通路分析,与益肾骨康方抑制肺癌A549细胞的作用相关机制主要涉及细胞凋亡方面。从KEGG富集结果中,选取最显著的20个KEGG通路绘制散点图进行展示。见图4。

图3 益肾骨康方组与对照组差异表达基因的 GO功能富集分析

图4 益肾骨康方组与对照组差异表达基因的 KEGG功能富集分析

2.2.3 PPI网络 PPI网络包含290个节点和743条边。通过MCODE插件筛选出核心基因,根据Degree值筛选出与益肾骨康方生药抑制肺癌细胞增殖和转移关系密切的2个基因:MMP9和CCL2,节点度(Degree)分别为36和27。益肾骨康方高剂量组与对照组比较下调了MMP9和CCL2基因的表达。见图5。

图5 与中药抑制肿瘤转移相关的差异表达基因蛋白互作网络图

3 讨论

中医药是我国的民族瑰宝,我国中药资源丰富,价格相对低廉,寻找有效的抗肿瘤中药是研究的热点。中药有效成分及复方抗肺癌机制包括抑制细胞生长、增殖、迁移、黏附、侵袭以及诱导细胞凋亡、自噬等方面,其内在机制多为可调节多个分子、通路及基因水平的物质[6]。益肾骨康方具有补肾健脾,解毒化瘀,渗湿消肿,抗癌止痛的功效,该处方中包含多味中药单体,现代药理学研究发现均具有抗肿瘤作用。课题组前期细胞实验研究也发现益肾骨康方可以抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移等。

本研究通过扫描电镜发现益肾骨康方作用于A549细胞24 h后,促使A549细胞表面的膜皱减少、丝状伪足断裂及凋亡小体形成,从而降低了A549肺癌细胞转移活性以及诱导癌细胞发生凋亡[7-9]。

通过GO功能富集分析发现与益肾骨康方抑制肺癌A549细胞的作用机制相关的差异表达基因主要涉及细胞黏附和外源性凋亡信号通路等。通过KEGG通路分析显示与益肾骨康方抑制肺癌A549细胞的作用机制相关的通路主要涉及到细胞凋亡方面。

本研究通过比较益肾骨康方组和对照组,我们筛选出差异倍数至少2倍(|log2FoldChange|>1)且具有统计学意义的差异表达基因,共440个。通过查阅文献我们得到了一个与癌症密切相关的基因SOX2,它在益肾骨康方组中表达下调。Y染色体性别决定区域盒2(Sex Determining Region Y-box 2,SOX2)属于SOX(SRY样高速泳动族蛋白盒)基因家族成员,是干细胞核心转录因子,参与维持干细胞的多能性、增殖、自我更新、多向分化及重新编程等[10-11]。多项研究提示SOX2基因突变、甲基化或表达异常与多种癌前病变及肿瘤的恶性生物学行为有关[12-14],同时有研究显示SOX2参与了多种恶性肿瘤发生发展,SOX2过表达可以促进肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖,侵袭和转移[15-18]。由此我们可以推测益肾骨康方可能是通过下调SOX2的表达来发挥抑制肺癌A549细胞的增殖和转移活性。

本研究我们将440个差异表达基因利用生物信息学方法制作了PPI网络图,剔除孤立的节点,根据Degree值筛选出了排名前37的关键靶点,通过查阅文献分析找出了2个连接度较高且与肿瘤增殖转移相关的基因:MMP9和CCL2,其中连接度最高的基因是MMP9。在益肾骨康方组中肺癌A549细胞的MMP9、CCL2基因表达下调。在肿瘤发展过程中,基底膜破坏通常是支持肿瘤入侵和转移的重要步骤。基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)家族成员可以分为几个组,如明胶酶,胶原酶,基质溶酶,母质溶酶和膜型基质金属蛋白酶,MMP能够降解和修饰细胞外基质和基底膜的大部分成分[19-20],与肿瘤扩散及患者预后相关[21]。其中,MMP9是研究最广泛的MMPs之一。MMP9是降解细胞外基质中胶原蛋白和非胶原蛋白最重要的内肽酶,在多种肿瘤中高表达。MMP9在肿瘤的侵袭、转移及血管形成中发挥关键作用[22]。CC趋化因子配体2(CC Chemokine Ligand 2,CCL2)是趋化因子家族的成员。趋化因子家族是一类小分子分泌蛋白,能够引起白细胞向目的部位聚集,最终引起炎症反应[23]。CCL2可招募肿瘤相关巨噬细胞浸润肿瘤部位、促进破骨细胞成熟、免疫应答逃避和促进肿瘤新生血管生成,从而参与调控肿瘤细胞生长[24-26]。有研究表明CCL2在乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌和胰腺癌等癌症中高表达,与不良预后有关[27-29]。由此我们可以推测益肾骨康方可能是通过下调MMP9和CCL2表达来抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。

综上所述,益肾骨康方能促使肿瘤细胞发生凋亡,从而抑制肺癌细胞的生长活性和转移活性。益肾骨康方的抗肿瘤作用机制可能是通过下调SOX2、MMP9和CCL2基因的表达,最终抑制了肺癌A549细胞的增殖和转移能力。但是其发挥药理学作用的具体活性成分及更深层面的作用机制有待进一步研究。本研究利用转录组基因测序技术和生物信息学方法初步筛选出益肾骨康方作用的关键基因,但其在体内是否是通过该靶点发挥抗肿瘤作用还有待进一步的验证。