基于网络药理学探讨丹参饮治疗心绞痛的作用机制

李 莹 郭经奇 赵立群

(1 山东中医药大学,济南,250014; 2 山东中医药大学附属医院老年医学科,济南,250014)

心绞痛是心血管内科常见病变,多发生于中老年人,主要由于冠状动脉粥样硬化斑块形成,致使血管管腔狭窄、堵塞，或者劳动、情绪激动、寒冷刺激等引起冠状动脉痉挛,导致心肌急性、暂时性缺血缺氧,以发作性心前区疼痛或胸部不适为典型临床表现[1-2]。中医将其归为胸痹心痛范畴,其主要病机为气滞、血瘀。中医运用辨证论治和整体观念,对于心绞痛的治疗有着明显优势。丹参饮由丹参、檀香、砂仁三味中草药组成,首见于《时方歌括》卷下,其上记载丹参饮具有治疗心痛、胃脘痛的功效[3]。现代药理学研究证明,丹参饮对于治疗心绞痛等心血管疾病有明确疗效,其可通过降低血脂水平、影响细胞凋亡的相关基因表达以及抑制血小板聚集等以改善微循环、治疗心肌缺血[4-8]。

较西药治疗而言,中药复方的多成分、多靶点、多通路的特点,在心绞痛的治疗上有一定的优势,但中药复方制剂的实验研究多来自于动物实验,其作用于人体的物质基础及机制尚不完全明确。网络药理学可通过多种数据库进行网络分析,通过建立可视化网络关系图,对药物活性成分、作用靶点以及疾病的靶点蛋白进行分析,预测其作用机制,以填补现代药理学研究的不足之处[9]。因此,本研究通过网络药理学方法,构建丹参饮成分-靶点-疾病网络进行分析,以探究其物质基础、作用机制为中医药的发展、临床应用及药理学研究提供新的思路及依据。

1 资料与方法

1.1 丹参饮活性成分的收集筛选 通过检索中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)以得到丹参饮中丹参、檀香、砂仁的所有活性成分,将口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)设为>30%,类药性(Drug Likeness,DL)设为>0.18以筛选及统计出丹参饮的主要活性成分。

1.2 丹参饮主要靶点的筛选 再次应用TCMSP检索丹参饮的相关作用靶点,并通过UniProt数据库(http//www.uniprot org/)对其作用靶点进行标准化处理,得到其官方名称(Official Symbol),并建立数据集。

1.3 心绞痛的靶点筛选 通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)以“Angina Pectoris”为关键词进行检索,得到心绞痛的疾病相关靶点,再将结果导入到Excel表格中进行整理筛选。

1.4 成分-靶点-疾病网络的建立 为将丹参饮对心绞痛疾病的作用机制阐述地更加明确、具体,把得到的丹参饮的相关靶点与心绞痛的疾病靶点取交集,并利用R 3.6.2软件绘制韦恩图。将韦恩图中所示的交集靶点导入Cytoscape 3.7.2软件中,获得成分-靶点-疾病网络图。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络的建立 将取得的交集靶点输入用于揭示蛋白质之间和预测PPI的STRING数据库(http://string-db.org/)[10],物种设定为“Homo Sapiens”,隐藏在网络中出现的断开的节点,将最低互作分数设为0.4,构建靶点蛋白可视化互作网络并导出。

1.6 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 通过Bioconductor数据库(http://www.bioconductor.org/)及R软件将筛选出的关键靶点基因的转化为基因ID,进行GO功能分析及KEGG通路富集分析,以明确丹参饮治疗心绞痛的生物过程及信号通路,并绘制通路网络图。

2 结果

2.1 丹参饮中药物活性成分及靶点筛选结果 检索出丹参饮的所有化学成分,包括丹参202个,檀香70个,砂仁165个,再根据OB>30%,DL>0.18,共筛选出丹参饮中药物的活性成分78个,其中丹参65个,檀香3个,砂仁10个。

2.2 药物-疾病有效成分靶点筛选结果 得到有效成分靶点120个。得到心绞痛的疾病靶点2 578个,利用R X64 3.6.2软件将其与药物的靶点取交集,建立药物-疾病数据集。见表2。得到共同靶点基因93个,相对应的活性成分59个。见图1。

图1 药物-疾病靶点韦恩图(药物与疾病有93个共同靶点)

表1 药物-疾病有效靶点

2.3 活性成分-靶点-疾病网络的构建 活性成分-靶点-疾病网络由154个节点,682条边组成。见图2。

图2 活性成分-靶点-疾病网络

2.4 PPI网络构建 93个有效靶点可视化PPI网络见图3。其中筛选出链接节点最多的20个靶点基因。见图4。

图3 PPI网络

图4 PPI网络中20个核心基因

2.5 GO功能分析及KEGG分析结果 得到主要GO条目20个。见图5。根据分析结果可知,丹参饮对心绞痛疾病的有效靶点基因主要涉及肾上腺素能受体活性(Adrenergic Receptor Activity)、G蛋白偶联胺受体活性(G Protein-Coupled Amine Receptor Activity)、泛素-蛋白连接酶结合(Ubiquitin-Protein Ligase Binding)、细胞因子受体结合(Cytokine Receptor Binding)、核受体活性(Nuclear Receptor Activity)等功能起作用。

图5 GO功能分析条目

KEGG通路富集结果显示147条通路,主要包括前列腺癌(Prostate Cancer)、内分泌抵抗(Endocrine Resistance)、乙型肝炎(Hepatitis B)、膀胱癌(Bladder Cancer)等疾病通路,以及IL-17信号通路(IL-17 Signaling Pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 Signaling Pathway)、TNF信号通路(TNF Signaling Pathway)等主要通路。见图6～7。

图6 KEGG主要通路气泡图

图7 KEGG通路示意图

3 讨论

心绞痛疾病随着老龄化社会的加重,发病率逐年增长,其发病原因复杂,本研究通过网络药理学方法研究丹参饮治疗心绞痛的作用机制,区别于单纯的西药治疗的单一分子、单一通路模式,建立活性成分-靶点-疾病网络图,体现中药复方制剂治疗疾病多成分、多靶点、多途径的优势。

通过TCMSP筛选出丹参饮中有效成分59个,作用于心绞痛疾病的有效靶点93个。其中作用靶点较多的3个活性成分分别是木犀草素(Luteolin)、丹参酮Iia(Tanshinone Iia)、豆甾醇(Stigmasterol)。经体外实验研究表明木犀草素可通过提高分解脂质酶的活性以显著降低大鼠的血脂水平[11],还可通过调节炎症介质IL-1β,IL-2等细胞因子,抑制炎症反应,改变部分信号通路、减少细胞内活性氧的产生等发挥抗炎、抗氧化的作用[12]。丹参酮ⅡA具有抗心肌缺血、减轻动脉粥样硬化以及舒张血管的作用,实验研究发现丹参酮ⅡA可抑制新西兰白兔动脉粥样硬化斑块的形成并增加其稳定性以防破裂[13-15]。豆甾醇具有抗氧化、抗炎症反应及降低胆固醇的作用,能有效地降低人结肠癌上皮细胞对胆固醇的吸收[16-19]。

本研究通过活性成分-靶点-疾病网络图、韦恩图以及PPI网络图得到丹参饮治疗心绞痛疾病的主要靶点93个,AKT1、IL6、FOS、VEGFA、CASP3为其中重要的5个靶点蛋白。王静等[20]通过大鼠实验,采用TUNEL法检测发现转染AKT1基因会抑制心肌细胞的凋亡,其保护心肌细胞的机制可能与抑制Cyt-C的释放,保护心肌线粒体有关。IL6作为一种炎症介质可能通过促进脂质的沉积、血栓的形成、血管平滑肌的增生、血管内皮的损伤等多种途径参与冠状动脉粥样硬化的形成与进展[21]。FOS除了与癌症相关,还参与了心肌纤维化的发生和发展,杨洁等[22]研究发现,miR-29c过表达可显著促进小鼠心肌细胞的增值和抑制心肌纤维化,而FOS的过表达则会逆转此作用,因此FOS与心肌细胞的凋亡与心肌纤维化密切相关。VEGFA能促进血管内皮细胞增殖,可能促进冠脉侧支循环的形成,李莹鸿等[23]通过临床研究发现,通阳宽胸颗粒能改善稳定型心绞痛患者症状,且使VEGFA表达水平升高。既往研究表明冠心病心绞痛患者胱天蛋白酶-3的表达显著提高,徐兴伟等[24]证实,姜黄素胶囊对心绞痛有较好疗效,且能明显降低血清中胱天蛋白酶-3的表达。综上看来,丹参饮通过影响多种蛋白的表达来治疗心绞痛。

通过GO功能分析表明,丹参饮的主要药物丹参、檀香、砂仁作用于疾病心绞痛的靶点主要参与肾上腺素能受体活性、G蛋白偶联胺受体活性、泛样-蛋白连接酶结合、类固醇激素受体活性、细胞因子受体结合、酰胺结合、内肽酶活性等生物过程起作用。

KEGG富集分析主要涉及前列腺癌、内分泌抵抗、乙型肝炎等疾病通路,IL-17信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等。白细胞介素-17是一个重要的促炎症介质,主要由Th17分泌,IL-17信号通路既可以促进中性粒细胞、单核细胞等炎症反应细胞的聚集,又能通过TRAF6激活下游核因子κB通路促进炎症反应[25]。王俊岩等[26]实验发现动脉粥样硬化小鼠的主动脉组织中HIF-1αmRNA表达水平显著提高,因此抑制HIF-1信号通路的激活能有消抗动脉粥样硬化。TNF信号通路的激活,也能激活下游核因子κB通路,促进TNF-α、IL-6等炎症介质的释放,从而加快动脉粥样硬化的进展[27]。分析看出,丹参饮可能通过多种疾病通路、信号通路治疗心绞痛。

综上所述,通过网络药理学这种新思路、新方法探究发现,丹参饮通过多种靶点、多种生物过程和通路治疗心绞痛,可能包括抗炎、抗氧化、改善内皮功能、促进血管生成等作用,但仍有部分结果需要进一步实验研究,为临床诊疗提供理论依据[28]。