微滴式数字PCR定量检测鸡毒支原体方法的建立

谢志勤，谢芝勋，张艳芳，范 晴，谢丽基，万丽军，罗思思，李 孟，张民秀，曾婷婷，黄娇玲，王 盛，李 丹，韦 悠，李小凤，任红玉，阮志华

（广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）主要侵害鸡，引起不同日龄、不同品种鸡发生慢性呼吸道病，轻者咳嗽、流鼻液，重者窦部肿胀、呼吸困难。MG 对雏鸡危害极大，除可导致呼吸道疾病外，还可引起雏鸡生长迟缓，发育不全，淘汰率非常高。MG 可引起蛋鸡产蛋减少[1-2]。种鸡感染MG 后可在体内长期带有病原。MG 一旦感染鸡群就很难被彻底清除[3-4]，可在鸡群中长期存在并可扩散至其他鸡群，极易继发或并发大肠杆菌、传染性支气管炎病毒等病原体感染，导致鸡群死亡，给养禽业带来重大经济损失[5-6]。

鸡MG 感染很普遍，正呈世界性流行态势。MG 引发的症状与其他病原如H9N2 亚型禽流感病毒、鸡新城疫病毒引起的症状很相似，临床上很难区分，需要通过实验室方法进行诊断。常用的实验室鉴别MG 方法有病原分离鉴定[7]、PCR 方法[8]、荧光定量PCR 方法[9-10]、LAMP 方法[11]等。但这些方法都或多或少存在不足，不能满足低拷贝数MG，如MG 感染早期的定量检测需求。例如：病原分离鉴定方法虽准确，但操作繁琐，费时费力；普通PCR 方法检测不够灵敏，且需要电泳；荧光定量PCR 方法能进行相对定量检测，检测MG 的灵敏度达100 拷贝/μL，但每次检测结果会因荧光定量PCR 内参的稳定性及扩增Ct 值的变化而变化；LAMP 方法虽敏感，但操作中易受污染，假阳性较多。目前缺乏绝对定量检测MG 的方法，需要建立一种更敏感的绝对定量检测方法，特别是针低拷贝数样品，如MG 早期感染的绝对定量检测，这对准确诊断防控MG 感染有重要意义。

微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近几年发展应用起来的一种新技术，其将反应液通过油包水方式、分为数万个独立的纳米反应微滴，根据每个反应微滴信号统计阳性拷贝数。目前该技术在很多领域包括动物疫病病原检测方面已有成功应用，证明其在动物疫病病原检测方面敏感性好，能实现绝对定量检测[12-13]。目前还没有建立ddPCR 检测MG 方法的报道。本研究以MGmgpc基因为靶基因，建立ddPCR 定量检测MG 方法，旨在为更加准确定量检测MG 提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 病原及临床样品

MG 株（MG S6、MG K2221、MG A5969）、鸡滑液囊支原体（MS）K1415 株、禽衣阿华支原体（MI）K-1805 株、禽脑脊髓炎病毒（AEV）Van 株，由美国康涅狄格洲州立大学Khan Mazhar I.教授惠赠；禽偏肺炎病毒（APV）MN-10 株，由美国滨夕法尼亚州立大学Lu Huagang 教授惠赠；鸡传染性支气管炎病毒（IBV）Mass 41 株、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）BJ 株、鸡新城疫病毒（NDV）LaSota 株、禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株、H9N2 亚型禽流感病毒（H9N2 AIV）066C 株，由广西壮族自治区兽医研究所实验室鉴定保存；鸡白痢沙门氏菌（SP）C79-13 株和鸡大肠杆菌（E.coli）O2 株，购自国家兽医微生物菌株保藏管理中心；60 份病鸡喉拭子、气囊拭子及肺样品，于2021 年1—12 月从广西7 个鸡场采集并保存于-80 ℃。

1.2 主要试剂及仪器

Supermix for Probe ddPCR（No dUTP，货号1863024）、Droplet generation oil for Probes ddPCR（货号1863005）、Droplet Reader Oil（货号1863004）、DG8 Cartridges（货号1863008）、DG8 Gaskets（货号1863009）、Pierceable Foil Heat Seal（货号1814040），购自美国Bio-rad 公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit（货号N20527），购自北京全式金生物技术有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit，购自天根生化科技（北京）有限公司；RT-PCR 扩增试剂盒、Premix ExTaq试剂盒、100 bp DNA Ladder、pMD18-T 载体、大肠杆菌DH5α、T4 连接试剂盒、凝胶回收试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司；微滴生成仪（QX200 Droplet generator）、热封仪（PX1）、微滴数字读取仪（QX200 Droplet Reader）、梯度PCR 扩增仪（T-100），购自美国Bio-rad 公司；荧光PCR 仪（quantStudio 5）、分光光度计（Nanodrop 2000），购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 引物设计与合成

根据已发表的MGmgpc基因（No.JX869132.1）序列，利用在线https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/软件，设计ddPCR 特异性引物和探针，并在线进行BLAST 分析。在探针序列5'端添加FAM 荧光基团，3'端添加BHQ1 淬灭基团。引物及探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并经HPLC 纯化。所设计的引物和探针序列见表1。

表1 所用的引物和探针序列

1.4 病原核酸提取

按EasyPure Viral DNA/RNA Kit 说明书提取1.1 中的病毒株DNA/RNA，按TIANamp Bacteria DNA Kit 说明书提取MG S6、MG K2221、MG A5969 以及MS、MI、ILTV、SP 及E.coli等菌株的DNA，提取的DNA/RNA 直接用于扩增或于-80 ℃保存备用。

1.5 重组质粒标准模板构建与鉴定

提取MG S6 总DNA 后作为模板，用引物MG F/MG R 扩增后，克隆至与pMD18-T 载体构建重组质粒pMD18-MG，经PCR 鉴定后由宝生物工程（大连）有限公司测序，测序正确的质粒DNA用分光光度仪测定D260nm/D280nm值，并按公式计算拷贝数。拷贝数=（浓度×阿伏加德罗常数）/（1 个碱基对的平均相对分子质量×总长度）。

1.6 ddPCR 反应体系建立及条件优化

20 μL 反应体系：2×Supermix 10 μL，5～40 μmol/μL 的 MG F/MG R 各 1 μL，2.5～40.0 μmol/μL MG Pro 1 μL，标准质粒模板2 μL，加灭菌 ddH2O 补足至20 μL。微滴生成：在DG8 Cartridges 的第二排孔分别加入上述反应液20 μL，第三排孔每孔加入droplet generation oil 70 μL，盖上DG8 Gaskets，置微滴生成仪上自动生成微滴于第一排孔。封膜：吸取生成的微滴至96 孔板内，加铝膜Pierceable Foil Heat Seal 置PX1热封仪上，程序设置为180 ℃ 10 s 进行封膜。PCR扩增：封膜的96 孔板放入PCR 扩增仪上进行扩增。设计反应程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火温度设置50～60 ℃ 1 min（2 ℃/s），共进行40 个循环；98 ℃ 10 min，4 ℃结束。数据读取及分析：反应结束后，将96 孔板置QX200 Droplet Reader上读取信号并进行数据分析。

1.7 ddPCR 特异性测定

提取NDV、H9N2 AIV、IBV、ARV、AEV、APV 的总RNA 并反转录为cDNA，提取MG S6、MG K2221、MG A5969 以及MS、MI、ILTV、SP 及E.coli的DNA 分别作为模板，按照优化的ddPCR 方法进行检测，评估该方法的特异性。

1.8 ddPCR 灵敏度测定

测定重组质粒标准品浓度并进行10 倍倍比稀释（10-4～10-11）后作为模板，按照优化的ddPCR方法检测，评估该ddPCR 方法的敏感性。同时采用荧光定量PCR 方法，用同样的引物探针，对相同质粒标准品浓度进行平行检测，比较两种方法的灵敏度。同时取5 个稀释度进行4 次平行试验，分析ddPCR 检测的线性区间。

1.9 ddPCR 重复性测定

取10-5～10-73 个连续稀释度的质粒标准品为模板进行3 次ddPCR 扩增反应，通过计算3 次反应结果的变异系数来验证ddPCR 的重复性。

科学技术是经济发展的第一生产力，也是推动实现全面持续发展的必然要求，人才是发展科学技术不可或缺的部分，因此必须注重对人才的培养，尤其是对企业内部高层管理人员素质的培养，通过这种方法使得企业能够在面对各种情况时更好地决策，更好地发挥产业园区的内部优势，为企业的长远发展做出贡献，从而促进当地的产业发展，推动经济向着更加合理、稳定、高效的方向发展。

1.10 临床样品检测

取约5 g 肺样品，按质量比1:8 加入无血清的DMEM 培养液研磨，在喉及气囊拭子中，分别加入2 mL 无血清的DMEM 培养液混匀，-70 ℃反复冻融3 次，4 000 r/min 离心5 min，取上清，14 000 r/min 离心10 min，弃上清，按TIANamp Bacteria DNA Kit 说明书步骤提取沉淀中的总DNA。用建立的ddPCR 方法进行检测，同时用文献[10]中的荧光定量PCR 方法进行检测，比较两种检测方法检测效果的符合率。

2 结果与分析

2.1 重组质粒标准品鉴定

挑取重组质粒pMD18-MG 进行PCR 鉴定，结果扩增出大小约198 bp 的明亮条带；送宝生物工程（大连）有限公司进行测序，用MegAlign 软件将测定的序列与MGmgpc基因（No.JX869132.1）序列进行Clustal W Method 分析，结果发现测定的序列与MGmgpc基因100%同源，序列正确；用分光光度仪测定的重组质粒pMD18-MG 标准品D260nm/D280nm值为1.90，按公式计算的拷贝浓度为1.35×1010拷贝/μL。

2.2 ddPCR 反应条件优化

ddPCR 反应中，对不同引物浓度和探针浓度进行优化，当MG F/MG R 引物浓度和MG Pro 浓度分别为20 和10 μmol/μL 时，即MG F 和MG R终浓度为1 μmol/μL，MG Pro 为0.5 μmol/μL 时，阳性微滴信号高，阳性微滴与阴性微滴之间的荧光信号区分明显，此时的引物、探针浓度为最佳反应浓度。用最佳引物浓度和探针浓度，退火温度设50、51、52、54、55、56、58、60 ℃共8 个不同梯度，对相同模板浓度进行ddPCR 反应扩增，结果退火温度为55 ℃时，阳性微滴信号（显示为蓝色）和阴性微滴信号（显示为黑色）之间的荧光信号区分明显，扩增获得的阳性微滴数最高，此时的退火温度55 ℃即为最佳退火温度。

2.3 优化后的ddPCR 反应体系及程序

20 μL 反应体系：2×Supermix for probe（No dUTP）10 μL，20 μmol/μLMG F/MG R 引物各1 μL，10 μmol/μLMG Pro 1 μL，DNA/RNA 模板2 μL，用 ddH2O 补足至20 μL。反应程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，设置退火温度55 ℃1 min（2 ℃/s），40 个循环；98 ℃ 10 min，4 ℃结束。

2.4 ddPCR 反应特异性测试

将NDV、H9N2 AIV、IBV、ARV、AEV、APV 的总RNA 并反转录为cDNA，然后与MG S6、MG K2221、MG A5969 以 及MS、MI、ILTV、SP 及E.coli的DNA 一起分别加入已优化好的ddPCR 反应体系中进行特异性检测。结果显示，每孔扩增总微滴的生成量均达1 万以上，且较均衡，说明微滴扩增反应成立。出现阳性微滴的病原有MG S6、K2221、A5969，其他病原无阳性微滴出现，与MG 株也没有出现交叉反应（图1），表明该方法的特异性强。

2.5 ddPCR 灵敏度测定

取10-4～10-11稀释的pMD18-MG 重组质粒标准品各2 μL 作为模板，分别按照优化的ddPCR 和荧光定量PCR 进行检测。结果显示，ddPCR 对质粒标准品的最低检测限为3.9 拷贝/μL（10-8稀释，图2-A），而荧光定量PCR 只检测到10-7稀释的质粒标准品（40.6 拷贝/μL，图2-B），10-8稀释的质粒标准品没有被检出。用5 个连续稀释的MG重组质粒标准品及检测阳性拷贝数的对数值，绘制ddPCR 绝对定量曲线，结果为线性。线性方程为y=-1.007x+8.63，斜率为-1.007，R2为0.999（图3）。

2.6 ddPCR 重复性测定

表2 ddPCR 重复试验结果

2.7 临床样品检测

对60 份病鸡喉拭子、气囊拭子及肺样品进行检测，ddPCR 检测结果为MG 阳性9 份，分别为喉拭子样品2 份、气囊拭子样品6 份及肺样品1 份，样品中检出的MG 拷贝数浓度为12.2～972.0 拷贝/μL，阳性检出率为15.0%（9/60）；荧光定量PCR 检测结果为MG 阳性8 份，分别为喉拭子样品2 份及气囊拭子样品6 份，阳性检出率为13.3%（8/60）。从检测结果看出，ddPCR 检出率高于荧光定量PCR。部分样品检测结果见图4 和表3。

表3 60 份临床样品检测结果 单位：份

3 讨论

鸡MG 感染较为普遍，感染率高，难以清除。准确诊断是防控MG 感染的重要手段。目前在众多的检测诊断方法中，没有一种方法能及时准确对MG 早期感染进行绝对定量检测。本ddPCR 检测方法的建立，实现了对低拷贝数MG，如MG 早期感染的准确绝对定量检测。经特异性检测验证，本方法只检出MG，没有检出其他常见禽病病原，也没有发生交叉反应，说明本方法具有很好的特异性。

dPCR 方法虽然是在荧光定量PCR 的基础上发展而来的，但这两种检测方法有所不同。ddPCR方法是通过直接计算反应的微滴数来实现对拷贝数的绝对定量检测，受扩增效率影响较小[11]，可直接读取结果且结果直观准确；而荧光定量PCR 需要通过标准曲线及扩增的Ct 值来计算标准品的拷贝数，常因检测的内参稳定性及Ct 值变化而影响结果。在敏感性检测方面，已有报道认为ddPCR方法比荧光定量PCR 方法敏感，如刘洋等[14]建立的ddPCR 检测方法比荧光定量PCR 方法灵敏度高10 倍。本研究建立的方法经灵敏度检测，证明检测限为3.9 拷贝/μL 的MG 重组质粒标准品模板，而荧光定量PCR 方法只检测到40.6 拷贝/μL。这一结果进一步证明了ddPCR 检测方法比荧光定量PCR 方法灵敏度高10 倍。由此表明，本研究建立的方法灵敏度，可实现个位拷贝数的绝对定量检测，这将有助于对低拷贝数MG 的定量检测。

用本研究建立的方法，对采集的临床样品进行检测，采用ddPCR 方法检出MG 阳性9 份，阳性检出率为15%，荧光定量PCR 方法检出MG 阳性8 份，拷贝数浓度为12.2 拷贝/μL 的样品没有检出，阳性检出率为13%。从检测样品的结果分析，ddPCR 方法的阳性检出率高于荧光定量PCR 方法，而且ddPCR 方法可以直接显示检测出的拷贝数，结果直观准确，实现了对低拷贝数MG 或需要绝对定量样品的检测，为定量检测MG 提供了更加准确的方法。

目前ddPCR 技术在各领域已得到广泛应用，在动物疫病检测方面也发挥了重要作用[15-16]。目前制约国内ddPCR 技术广泛应用的主要问题是仪器设备需要进口，试剂昂贵，且操作步骤复杂，要求高。相信不久的将来，会实现仪器及试剂的国产化，这样ddPCR 技术将随着检测成本的大幅降低而得到更广泛应用。