我国猪流行性腹泻病毒流行现状及分子遗传演化特征

左媛媛，徐天刚，戈胜强，路皓东，吴晓东

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.山东农业大学，山东泰安 271018）

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属于冠状病毒科甲型冠状病毒属，可引起猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED），导致患病猪腹泻、呕吐、厌食、脱水和体重减轻，并可导致哺乳仔猪大量死亡[1-2]。PEDV有囊膜，基因组为单股正链RNA，长度约28 kb，含有7 个开放阅读框（ORFs），分别编码2 个大的多聚蛋白（pp1a 和pp1b）、4 个结构蛋白[棘突蛋白（S）、膜蛋白（M）、囊膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）]和1 个附属蛋白（ORF3）。S蛋白是三聚体糖蛋白，位于病毒粒子表面，在病毒粘附、受体结合以及病毒进入细胞时与细胞膜融合方面起重要作用[3-4]。S 蛋白分为N 端的S1 区和C端的S2 区，其中S1 区受到的免疫压力大于S2 区，因此S1 区与PEDV 毒力有关，并且在免疫压力下可快速突变。S 蛋白也是产生中和抗体的主要蛋白，目前已鉴定出至少5 个中和抗原表位：N 端的S10区（NTD/S10）、胶原蛋白酶等效区（COE）、S1D 区的SS2 和SS6、C 端的2C10。因此，S基因常用于PEDV 遗传演化研究[5-6]。

PED 于1971 年首次在英国被报道，起初被命名为流行性病毒腹泻（EVD）。1978 年，比利时科学家通过试验证实了这种新发现的冠状病毒可导致猪腹泻，将其命名为CV777。1982 年，由该种病毒引起的仔猪腹泻被规范命名为PED[7]。到2000年，PED 在欧洲得到基本控制，但在亚洲，其危害程度仍然较严重，中国、日本、韩国等国家都有PED 流行。2010 年末，一种新型高致病性PEDV引发的疫情在我国华南地区某猪场暴发，并很快扩散到全国。亚洲（日本、泰国、韩国、菲律宾等）和美洲（美国、加拿大、墨西哥等）等地区也暴发此类疫情，导致大量哺乳仔猪死亡，给全球养猪业造成严重经济损失。2013 年PEDV 传入美国后，造成占美国养猪总量10%的700 万头仔猪死亡；然而在欧洲（乌克兰除外）、非洲以及澳大利亚没有发现高致病性PEDV 流行[8]。本文将对PEDV在我国的流行特点及其遗传演化关系进行综述，以期为PED 的预防控制，特别是疫苗研制提供参考。

1 国内PED 流行特点

据文献[9]报道，早在1973 年我国可能就有PED 流行。20 世纪80 年代早期到2010 年，PED在我国一直呈散发或地方性流行，未见类似日本和韩国的大流行。据不完全统计[10]，1987—1989 年全国26 个省（自治区、直辖市）由PED 导致的死亡率占36 种猪病总死亡率的1.74%，而传染性胃肠炎（TGE）占到9.53%。2004 年在广西壮族自治区6个城市开展的调查[11]显示：PED 发病率为42.00%（4 658/11 090），病死率为5.69%（265/4 658）；中小猪发病率为46.70%（4 302/9 212），病死率为6.16%（256/4 302）；母猪发病率为18.96%（356/1 878），没有出现死亡。以上调查数据表明，PEDV 主要引起仔猪发病和死亡，而对成年母猪引起的发病率低，症状也不严重。调查资料[12]显示：2005—2007 年仔猪发生PED 占仔猪腹泻的46%。另一项研究[13]应用多重RT-PCR 方法，检测2009—2010 年从全国多个省份采集的197 份仔猪腹泻样品，结果发现PEDV 阳性检出率为29.44%（58/197）、TGEV 为0.51%（1/197）、猪轮状病毒（PoRV）为7.61%（15/197）。上述结果表明，尽管PED 呈散发状态，但PEDV 一度是引起我国仔猪腹泻的主要病原之一。

2010 年10 月前，PEDV 灭活疫苗和弱毒疫苗的使用较好地控制了全国PED 的流行，但2010 年冬天，华南地区某猪场暴发新型高致病性PED 并很快传遍全国，至少有29 个省（自治区、直辖市）报道发生了PED 大流行。此次PED 暴发的特点是流行范围广，在发病地区几乎波及所有养猪场，不仅在我国大面积流行，在美国、墨西哥、日本、韩国、越南、泰国等全球主要生猪产地也都有大面积流行。研究[14]显示，2010—2011 年从华南、华东和华中地区9 个省份采集的600 多份猪组织和粪便样品中检测到的PEDV 平均阳性率为58.32%。2012 年，从全国12 个省份采集仔猪小肠组织和粪便样品，用RT-PCR、胶体金等方法进行检测，结果发现PEDV 感染率高达61.19%（134/219），显著高于TGEV 和PoRV[15]。2011 年2 月—2014 年3 月，在全国29 个省份开展PED 流行病学调查[16]发现，样品阳性率为61.10%～78.49%，场阳性率为71.43%～83.47%。2016 年，从全国17 个省份采集1 272 份样品进行检测，发现PEDV 阳性率为28.93%[17]。另外一项研究[18]则显示，2012—2017年从全国15 个省份采集的1 542 份猪腹泻样品中，有1 235 份检测为PEDV 阳性，阳性检出率高达80.09%。具体到各省份情况来看：2013—2017年在云南省采集的435 份猪腹泻样品中，PEDV阳性检出率为17.47%[19]；2014—2018 年从四川省和贵州省156 个猪场采集的645 份猪腹泻样品中，有84 个猪场检测到PEDV，样品阳性检出率为35.81%[20]；2015—2019 年在河南省采集的575份猪腹泻样品中，PEDV 阳性检出率为51.65%，其中2015 年（40.68%）到2017 年（39.29%）流行相对稳定，2018 年大幅度提高（74.19%）[21]；2017—2018 年，从湖南省39 个猪场采集的184份腹泻样品中，71.79%（28/39）的猪场检测到PEDV，样品阳性率为38.04%（70/184）[22]。2019 年，Chen 等[23]对PubMed、Google scholar、Cochrane library、Clinical Trials 以及中国知网和维普数据库中有关我国大陆地区PEDV 流行的45 篇文章进行统计，时间跨度为1988 年1 月—2018 年8 月，结果发现PEDV 平均流行率为44%，其中北方地区为37%，低于其他地区。以上调查结果表明，自2010 年以来，PED 在我国大范围流行，是导致仔猪腹泻的主要疾病，严重危害我国养猪业健康发展。

2 仔猪PEDV 感染特征

2010 年以后流行的PEDV 主要引起哺乳仔猪发病，以2～7 日龄仔猪发病率最高，发病最严重。10 日龄内仔猪感染后出现腹泻，首先表现为严重的水样腹泻，并伴发呕吐、精神沉郁，在发病仔猪躺卧的地方会出现大量黄色恶臭的水样便；2～4 日后大量死亡，死亡率一般为50%～100%。2013 年PEDV 导致华南地区超过100 万头仔猪死亡，发病猪场生产率受到严重影响，严重破坏了我国生猪养殖业的健康发展，但对妊娠母猪和其他生长阶段猪群致病力不高，临床症状较轻[14，24～25]。2015—2019年对河南发病猪场采集的575 份样品检测发现，哺乳仔猪PEDV 阳性检出率达到60.47%，而育肥猪和母猪相对低，分别为43.28%和29.37%[21]。2010 年以后发生的PED 季节流行特征不明显，被PEDV 污染的猪场全年都可发生仔猪腹泻，但在秋冬季节或冬春季节变换期间，由于气温变化显著，发病率相对更高。例如，春季和冬季采集样品的PEDV 阳性检出率较高，分别为54.10%和66.87%，而夏季和秋季相对较低，分别为23.40%和40.43%[21]。研究[26]还发现，PEDV 引起猪腹泻的同时，常伴随着其他肠道病毒感染。2015—2018 年从全国22 个省份采集543 份腹泻样品进行检测发现，PEDV 阳性检出率为66.85%，与其伴发感染的有13 种肠道病毒[猪捷申病毒（PTV）、TGEV、猪萨佩洛病毒（PSV）、猪肠病毒（PEV）、哺乳动物呼肠病毒（MRV）、猪A 组轮状病毒（GARV）、猪星状病毒（PAstV）、猪环曲病毒（PToV）、猪托克特诺病毒2 型（TTSuV-2）、猪博卡病毒（PBoV）、猪嵴病毒（PKV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）]，阳性检出率最低为3.58%（PSV），最高为81.55%（PKV）。不过在部分地区，PEDV 与常见猪腹泻病毒混合感染的程度较低。2017—2018 年，从云南省39 个猪场采集184 份腹泻样品进行检测发现，PEDV+TGEV 共感染率为1.09%（2/184），PEDV+PoRV 共感染率为3.26%（6/184），没有发现PEDV+TGEV+PoRV三重感染[19]。

3 PEDV 流行毒株基因分型

3.1 基因分型依据

为了更好地区分不同毒株，依据毒株出现的时间不同，将PEDV 笼统地分为经典毒株和新变异毒株[27]。经典毒株是20 世纪70 年代出现的毒株，而新变异毒株是指2010 年以后全球流行的毒株。根据PEDV 的S基因或其N 端高变区S1区序列的同源性，将PEDV 分为2 个基因型——G1 型和G2 型，其中G1 型又分为G1a 和G1b 亚型，G2型又分为G2a 和G2b 亚型。2014 年1 月，美国研究人员从1 份疑似PEDV 感染样品中分离到1 株PEDV，将其命名为OH851，样品来源于感染母猪，但其哺乳的仔猪症状较轻，甚至无临床腹泻症状，也不死亡。与美国流行株（G2a）S基因序列比较发现，OH851 毒株的S基因有3 个缺失位点（167位缺失1 个碱基，176 位缺失11 个碱基，416 位缺失3 个碱基）和1 个插入位点（474～475 位有6 个碱基插入），同时，在S基因S1区的N 端1 170 bp片段上还有几处核苷酸突变[28]。OH851 变异株S基因的碱基缺失、插入和突变很有可能是导致仔猪临床症状减轻的原因[29]。该类新出现的毒株被命名为“S INDEL”毒株，其特点是对哺乳仔猪致病力低，致死率低，构成了G1b 亚型（图1）[30]；而与之相对的新出现毒株被命名为“non-S INDEL”毒株。“non-S INDEL”毒株是指强毒力毒株，是引起目前全球PED 大流行的毒株，由G2a 和G2b亚型构成（图1）[30]。通常把以CV777 毒株为代表的经典毒株归为G1a 亚型。G1b（S INEDL）、G2a 和G2b 亚型都属于2010 年以后新出现的毒株，其中G1b 为低致病力变异毒株，G2a 和G2b 属于高致病力变异毒株，而G2b 为高致病力重组变异毒株。可以预见，随着PEDV 的流行和疫苗免疫压力的加大，PEDV 分子演化会一直持续，可能会不断出现新的分支、亚型或基因型。

3.2 流行株基因分型

2010 年前，亚洲多地发生PEDV 流行，但多呈散发状态[31]。对当时在亚洲流行的PEDV 毒株进行基因分型和来源地进化分析发现，这些毒株包括我国的4 个经典毒株（GenBank IDs：KC109141、JN547228、EF185992 和JX560761），1 个日本经典毒株（GenBank ID：KT968509）和3个韩国毒株（GenBank IDs：JQ023161、GU937797和KF898124）都属于G1a 亚型。2010 年末我国华南地区暴发新型高致病性PED 后，各地有关新出现PEDV 的分子特征和遗传演化关系的文献被大量发表。2012—2017 年从我国15 个省400 个猪场采集的猪腹泻样品中获得了1 235 条PEDV 的S1基因序列，通过遗传演化分析发现，这1 235 株PEDV 分别属于G1a、G1b、G2a 和G2b 亚型，占比分别为1.9%、9.6%、32.2%和56.3%；与经典毒株CV777（GenBank ID：AF353511）比较发现，G1a、G1b、G2a 和G2b 亚型毒株的同源性分别为88.1%～95.49%、92.52%～95.39%、75.00%～89.25%和79.39%～89.44%。我国目前流行的PEDV 主要是G2a 和G2b 亚型毒株[32]。另一项调查[26]显示：2016—2018 年从全国22 个省份采集样品中获得的147 条PEDV 的S1序列，与130 条参考序列比较发现，29.25%属于G2a亚型，70.75%属于G2b亚型，没有发现G1 基因型毒株；进一步分析发现，包括参考毒株在内的中国分离株中，64.79%的2011—2015 年流行毒株、50.62%的2016 年流行毒株、8.86%的2017—2018 年流行毒株属于G2a 亚型，19.72%的2011—2015 流行毒株、49.38%的2016年流行毒株和91.13%的2017—2018 流行毒株属于G2b 亚型。结果表明，从2010 年我国发生大面积高致病性PED 以来，流行的PEDV 属于G2a 亚型的比率逐年减少，而属于G2b 亚型的比率逐年增加（图2）。

在其他区域性研究[20]中，2014—2018 年从我国川贵地区15 个城市的代表性猪场获得了52条PEDV 的S全长基因，经遗传进化分析发现，13.73%的毒株属于“G1c”，1.96%属于“G2a”，23.53% 属于“G2b”，60.78% 属于“G2c”，没有发现G1a 毒株。需要说明的是，该研究中定义的“G2a”和“G2b”其实与通用G2a 属于同一分支，“G2c”即为通用的G2b，“G1c”即为通用的G1b。这些结果表明，我国西南地区PEDV 遗传背景复杂，有多个基因亚型毒株同时流行。这可能是我国频繁的生猪跨省长途调运，增加了PEDV 的流行风险和复杂性。2015—2019 年，从河南省采集的猪腹泻样品中扩增出22 条PEDV 的S基因序列，经遗传演化分析发现，16 株属于G2a 亚型（高致病性变异毒株），6 株（2017—2018 年）属于G1b亚型（低致病性S-INDEL），说明河南省流行的主要是高致病性G2a 亚型毒株；同时，2017 年以后出现低致病性G1b 亚型毒株，表明河南省流行的PEDV 毒株有不同的进化来源[21]。2017—2018年，在湖南、湖北、广西等8 个省份39 个猪场采集的184 份腹泻样品中，扩增出有代表性的14 株PEDV 毒株S1基因，经基因遗传演化分析发现，11 株属于G2a 亚型，并且与2011 年在湖北省分离的高致病强毒株AJ1102（JX188454.1）亲缘关系近，3 株属于G2b，与2012 年在安徽省分离的高致病毒株AH2012（KC210145.1）和美国2013 年分离的高致病毒株USA/Colorado/2013（KF272920.1）亲缘关系近[22]。

以上研究结果表明，2010 年以后在我国流行的PEDV 主要是高致病力毒株，分别属于G2a（变异强毒株）和G2b 亚型（重组强毒株），与经典毒株G1a 亚型包括CV777 弱毒株和强毒株亲缘关系远，与G1b 亚型（S-INDEL 类毒株）亲缘关系也较远。同时也看到，S-INDEL 毒株在我国流行比较复杂。一段时间认为2015 年分离的ZL29 是唯一一株S-INDEL 毒株，但后来发现2004 年分离的JS-2004-2、CH5 毒株和2012 年分离的CH/SDZB/2012 毒株也属于S-INDEL 毒株。这提示，早在2004 年我国可能就有S-INDEL 毒株流行，只是在2013 年前一直处于个别地区散发状态，低于G2 基因型毒株的流行范围，但2013 年以后，该亚型毒株开始在西南和华南地区流行[20]。这些信息表明，我国流行的PEDV 基因型复杂，有多种基因型同时流行。

4 PEDV 流行株变异

PEDV 全基因组序列分析表明，PEDV 变异株存在4 个高变区：V1—V4。V1主要包括nsp2基因的C 端和nsp3的N 端；V2位于S基因的S1区，参与病毒受体结合，该区域的改变可以导致PEDV跨物种或跨器官传播；V3包括S基因的C 端和ORF3；V4存在于N基因中，与以往认为的N基因高度保守的观点不一致[33]。PEDV 的S基因，特别是在S1区最容易发生变异。与经典毒株CV777比较，新出现的PEDV 变异株S1区（1～2 217 nt）存在3 个插入部位（162、170～180 和413～415 位）和1 个缺失部位（470～475 位），S1区也有3 个重要的抗原决定簇发生突变（248～280、442～499 和697～742 aa），这3 个抗原决定簇的改变可能是导致新出现PEDV 变异株毒力增强和经典疫苗株免疫保护失败的主要原因[31，34]。

对2016—2018 年的147 份样品扩增PEDV 的S1序列，经测序和同源性比较发现，147 个S1序列的核酸同源性为95.5%～99.9%，氨基酸同源性为94.2%～99.7%，而 与CV777（GenBank IDs：AF353511）比较，核苷酸同源性为90.7%～91.8%，氨基酸同源性为89.3%～90.7%。为进一步研究S1蛋白的遗传进化特点，从NCBI 上下载53 条S1序列（2011—2014 年24 条、2015 年29 条），并将推导出S1 蛋白氨基酸序列作为参考序列；将53 条参考序列与147 条获得的S1 蛋白氨基酸序列（2016年72 条、2017 年46 条、2018 年29 条）进行比较发现，2015—2018 年PEDV 的S1 蛋白平均氨基酸突变数分别是13.0、17.11、18.87 和16.17。S1 蛋白的V13A、L17F、G68Y、G70R、N139D、Y182H、M214T、P229L、T235I、I287M、H301Q、S334A、I503T、S524A、K570N、G616V和P638S 的氨基酸突变概率从2015 年到2018 年持续增加；2017 年PEDV 毒株S1 蛋白的L14I、A193S、R195N、D223G、T379I、G432S、E640V、F674V、D683A、P770L 和T781M 发生了突 变，2018 年V77A、H110Y、A112S、I154T、S246L、D304G、A331V、Y610H、A612D 和K637T 发生了突变[26]。

2017—2018 年，从我国湖南、湖北、广西等8 个省份39 个猪场采集的184 份腹泻样品中，扩增出有代表性的14 株PEDV 毒株S1基因，发现其中1 株（HN-SY-2017-Oct）有9 个核苷酸插入T1152GAA GCC AAT1160T，编码3 个氨基酸381KPI383，还有1 株（ZJ-2018-May）有3 个核苷酸缺失1126AAA1127，编码1 个氨基酸372K。14 株S1基因的核苷酸同源性为97.2%～100%，氨基酸同源性为95.8%～100%；与CV777 弱毒株S1（GenBank ID：KT323979.1）序列比较，核苷酸和氨基酸同源性分别为90.7%～91.6% 和89.1%～90.0%，而与CV777 强毒株（GenBank ID：AF353511）S1序列比较，核苷酸和推导氨基酸的同源性分别为90.7%～91.6%和88.5%～89.1%；与我国高致病性强毒株AJ1102（JX188454.1）的S1基因核苷酸和推导氨基酸同源性分别为97.3%～98.7%和97.2%～98.2%，与美国高致病性强毒株USA/Colorado/2013（KF272920.1）的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.9%～99.5%和97.2%～99.2%；而与致病力弱的S-INDEL OH851 株同源性较低，分别为91.9%～92.9%和90.7%～92.5%[22]。这也许能部分解释经典CV777 疫苗株预防PEDV 流行强毒株失败的原因。

研究[21]发现，我国流行的PEDV 毒株中存在S基因重组，从而出现新的重组毒株。为了确定PEDV 流行株S基因是否存在重组位点，采用RIP 软件分析高致病力变异株CH-HNAY-2017（G2a）、CH-HNZMD-2017（G1b，S INDEL）与参考毒株包括经典毒株（G1a 亚型CV777 和DR13）、S INDEL 毒株（G1b 亚型KNU-1406-1和OH851）、重组毒株（CH-HNYF14）和高致病力变异毒株（G2a 亚型CH-ZMDZY-11 和USA-Colorado-2013）。结果显示：分离株CHHNAY-2017（G2a）、CH-HNZMD-2017（G1b，S INDEL）的S基因上存在重组位点；CHHNAY-2017（G2a）的S基因与参考毒株CHZMDZY-11 和USA-Colorado-2013 有更高的相似性，CH-HNZMD-2017（G1b，S INDEL）S基因与参考变异株CH-ZMDZY-11、USA-Colorado-2013有更高的相似性。用Simplot 软件分析发现，CHHNAY-2017 和CH-HNZMD-2017 的S基因上都有几处潜在重组位点。这些结果表明，除了碱基的插入、缺失导致PEDV 毒株变异外，不同毒株S基因的重组也是PEDV 遗传进化的重要方式。

5 挑战及展望

PEDV 是目前危害我国养猪业最重要的病原之一，几乎在所有省份都有流行，并且通过基因的插入、缺失和重组等方式不断发生演化和变异。高致病力毒株、变异毒株不断出现，各类毒株之间的抗原性存在明显差异，导致临床上被感染仔猪发生腹泻的情况更加复杂。临床实践和研究表明，用经典毒株制备的疫苗预防新出现的变异毒株，免疫效果并不理想。已有试验证明，在细胞水平，用经典毒株诱发的抗体不能有效中和新出现的变异毒株。这些都表明，随着PEDV 的不断演化，用当前流行毒株研制新疫苗是预防PEDV 流行的持续性迫切需求。对于PEDV 的传播，除了经典的“粪-口”途径和最近确定的通过气溶胶经呼吸道感染途径外[35]，是否还有其他传播途径，是否可以通过乳汁经消化道感染和经胎盘垂直传播，这些都需要进行不断研究，以指导临床防制实践。同时，PEDV疫苗的免疫机制还不十分明确，血清中和抗体以及细胞免疫在疫苗免疫中的作用如何？是否只有乳汁分泌型IgA 在发挥免疫作用？以上这些问题都为有效防制PED 提出了新的挑战，同时也为今后开展PEDV 研究指明了方向。持续开展PEDV 分子演化分析以及疫苗免疫机理、新疫苗研究将有助于预防和控制PED 在我国的流行。