盐酸氯卡色林饱和溶解度、油水分配系数的测定及大鼠在体肠吸收

王重阳，蒋成君，王梦文，陶福林，朱文涛，汪电雷

(安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230011)

目前我国肥胖人口达3.25亿，导致心脑血管疾病及肿瘤的发病率大大提高[1-2]。盐酸氯卡色林是主要作用于脑中的5-HT2C受体，通过激动神经元使机体产生饱腹感而促使体质量减轻[3]的新型减肥药物，适用于体质量指数(BMI)≥27 kg/m2，并患有高血压、2型糖尿病或者高血脂的超重人群。5-HT2B受体激动剂通常会导致瓣膜性心脏病[4]，而盐酸氯卡色林作用于5-HT2C受体效力是5-HT2B受体的60倍，这使心脏受损的风险远远低于先前药物[5]，在临床Ⅲ期试验中发现盐酸氯卡色林在促使体质量减轻的同时不会发生心脏性疾病[6]，大大提升了药物的安全性。

本研究通过测定盐酸氯卡色林饱和溶解度及油水分配系数及其在体肠吸收考察，对盐酸氯卡色林的吸收部位和吸收动力学进行探讨，为剂型设计提供生物药剂学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试药 LC-16型高效液相色谱仪(岛津仪器有限公司)；Milli-Q GradientA10超纯水机(Millipore Inc.USA)；JL-180超声仪(南京科捷分析仪器有限公司)；AB135-S型分析天平(德国Mettler Toledo公司)；精密pH计(梅特勒-托利多公司，瑞士)；HJ-6B数显恒温多头磁力搅拌器(金坛区西城新瑞仪器厂)。盐酸氯卡色林(含量99.8%，批号2018511)、盐酸氯卡色林对照品(批号2016311)购于合肥久诺医药科技有限公司；乌拉坦(广州威佳科技有限公司，纯度98%，批号1700063)；色谱级乙腈(瑞典Oceanpak公司)；三氟乙酸(江苏强盛化工有限公司)；水为纯化水；其余均为分析纯。

1.2 动物 健康SD大鼠，雌雄各半，购于安徽中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(皖)2019-001，体质量(200±35)g。饲养条件：温度20℃～25℃，相对湿度50%～60%，12 h通风换气一次。在进行实验前12 h，可饮水需禁食。

2 方法与结果

2.1 饱和溶解度和表观油水分配系数的测定

2.1.1 溶液的制备 对照品贮备液的配制：精密称取盐酸氯卡色林对照品适量，以超纯水溶解得浓度为100 μg/mL的对照品贮备液，备用。

对照品溶液的配制：精密移取对照品贮备液适量，加流动相配制成浓度为0.5、1、3、6、12、24、30 μg/mL系列对照品溶液，备用。

供试品溶液的配制：精密称定盐酸氯卡色林适量，加流动相配制成浓度为0.5、1、3、6、12、24、30 μg/mL系列供试品溶液，备用。

2.1.2 盐酸氯卡色林含量测定方法的建立

2.1.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18(4.6 mm×20 mm,5 μm)；流动相：水-乙腈-三氟乙酸(70∶30∶0.1 V/V/V)，检测波长：222 nm，柱温：35℃，流速：1.0 mL/min，进样量：20 μL。

2.1.2.2 专属性 精密吸取空白溶液、对照品和供试品溶液20 μL，按“2.1.2.1”色谱条件进样测定，进行专属性考察，结果见图1。

A.空白溶剂；B.盐酸氯卡色林对照品；C.盐酸氯卡色林供试品溶液。

2.1.2.4 准确度、精密度及稳定性测定 取浓度为1、6、24 μg/mL的供试液进样分析。于1 d内连续进样5次考察日内精密度，于1 d内进样1次，连续5 d进样测定日间精密度[7]并考察相应的准确度。结果表明仪器的精密度良好，见表1。

表1 盐酸氯卡色林的精密度及准确度

取浓度为6 μg/mL的供试液，置于(37±1)℃水浴中，在0、2、4、8、12、24 h时取样，进样分析。结果显示峰面积RSD<2%，表明盐酸氯卡色林供试液在24 h内可维持稳定，见表2。

表2 盐酸氯卡色林含量测定溶液稳定性实验(n=5)

2.1.3 盐酸氯卡色林饱和溶解度的测定 参照文献[8～9]方法进行盐酸氯卡色林饱和溶解度实验。将离心后的上清液0.45 μm微孔滤膜滤过，用乙腈稀释至适当质量浓度，进样测定，记录峰面积。结果显示盐酸氯卡色林饱和溶解度均>400 mg/mL，见表3。

表3 不同pH下测得盐酸氯卡色林的溶解度及油水分配系数

2.1.4 盐酸氯卡色林表观油水分配系数的测定 参照文献[10～13]方法进行盐酸氯卡色林表观油水分配系数实验。取上层油相溶液稀释后进样分析，根据Cw=(C-Co)×稀释倍数，计算水相中盐酸氯卡色林的浓度，并计算油水分配系数P=Co/Cw。其中C为加入药物的初始浓度，Co为油相中药物浓度，Cw为水相中药物浓度，P为药物的油水分配系数。

结果显示盐酸氯卡色林在正辛醇-水体系及正辛醇-PBS体系中的表观分配系数lgP>2，见表3。

2.2 大鼠在体肠吸收考察

2.2.1 肠灌流溶液的配制 K-R液的配制：称取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、NaH2PO40.32 g、NaHCO31.37 g、MgCl20.02 g、葡萄糖 1.40 g、CaCl20.37 g以蒸馏水定容至1 L。

空白肠灌流液的配制：在大鼠小肠段两端插管，37℃生理盐水将肠内容物冲洗干净，用不含药物的K-R液快速充满肠段后，以0.28 mL/min的速度持续泵入各肠段，在出口处收集接收液，作为空白肠灌流液。

盐酸氯卡色林肠灌流液的配制：精密称取盐酸氯卡色林对照品适量，以空白肠灌流液稀释至12 μg/mL，备用。

2.2.2 大鼠小肠生物样品中盐酸氯卡色林含量测定方法的建立

2.2.2.1 专属性 分别取空白肠灌流液、盐酸氯卡色林肠灌流液和肠吸收样品溶液，按“2.1.2.1”色谱条件进样测定，结果表明空白肠灌流液在盐酸氯卡色林保留时间处没有吸收峰，其内源性物质对盐酸氯卡色林的测定没有干扰，该方法专属性良好。见图2。

A.空白肠液灌流液；B.空白肠灌流液+对照品(12 μg/mL)；C.肠吸收样品溶液。

2.2.2.3 盐酸氯卡色林在空白肠液中的稳定性考察 精密称取盐酸氯卡色林适量，加空白肠灌流液稀释至24 μg/mL的供试液，置于(37±1)℃水浴中。分别在0、1、2、4、8、12、24 h时取样分析，记录峰面积计算RSD值。结果显示RSD<2%，表明盐酸氯卡色林供试液在24 h内稳定性良好(n=5)。

2.2.3 单向灌流实验 参考文献[14～17]进行大鼠单向灌流实验。实验持续105 min，待实验结束后，将所灌流的肠段剪下，测量其长度(L)及周长，由3次周长求得平均内径(r)。将所取灌流样品经0.45 μm微孔滤膜滤过，进样分析，测定盐酸氯卡色林浓度。

本实验采用重量法校正灌流液的体积变化，计算盐酸氯卡色林吸收速率常数(Ka)和肠段表观吸收系数(Papp)，公式如下：

①

②

式中：Vin、Vout分别为灌流液、接收液的体积；Cin、Cout分别为灌流液、接收液中盐酸氯卡色林的质量浓度；V为肠段体积(通过L及r求出)；Q为灌流速度(mL/min)。

2.2.4 不同肠段吸收系数的比较 取SD大鼠6只，打开腹腔分离出十二指肠、空肠、回肠、结肠，按“2.2.3”方法用盐酸氯卡色林(6 μg/mL)供试液对4个肠段依次恒速灌流。计算并比较不同肠段中[18-19]盐酸氯卡色林的Ka和Papp。结果显示，盐酸氯卡色林在全肠段均有吸收，与盐酸氯卡色林在十二指肠的Ka相比，空肠、回肠和结肠均下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与盐酸氯卡色林在十二指肠的Papp相比，回肠和结肠均下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 盐酸氯卡色林在不同肠段吸收系数比较

2.2.5 不同浓度吸收系数的比较[20-21]取SD大鼠6只，以空肠为灌流肠段，配制盐酸氯卡色林(1、6、24 μg/mL)供试液，按“2.2.3”方法操作，分别以不同浓度的盐酸氯卡色林供试液恒速灌流空肠，计算并比较不同浓度的盐酸氯卡色林在大鼠空肠的Ka和Papp。结果显示，不同浓度的盐酸氯卡色林在大鼠空肠吸收的Ka和Papp差异均无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表5 不同浓度盐酸氯卡色林在大鼠空肠吸收系数的比较

3 讨论

本研究采用高效液相色谱法测定盐酸氯卡色林的饱和溶解度及油水分配系数，对于预测其在体内的吸收及渗透性具有重要意义。由于盐酸氯卡色林具有特殊的分子结构(酸碱两性)，在不同的环境下显现不同的酸碱性，因此在不同的pH环境下，发现其溶解度并未发生较大的改变，并且在不同的pH环境下均具有很好的溶解性(超过400 mg/mL)，表明盐酸氯卡色林是高溶解性药物。同时，盐酸氯卡色林在正辛醇-水体系及正辛醇-PBS体系中的表观油水分配系数lgP均>2，说明了盐酸氯卡色林易透膜吸收，并且口服易吸收[22-25]。

考虑到大鼠肠道灌流实验在肠道吸收药物的同时也会吸收水分，致使灌流液体积发生改变，因此本研究采用重量法对灌流体积进行校正。结果表明盐酸氯卡色林在全肠段均有较好的吸收，与其lgP>2口服易吸收预测结果相一致。且盐酸氯卡色林在肠道吸收不受浓度影响，其吸收机制可能属于被动扩散[26-27]。本研究结果为盐酸氯卡色林进一步缓控释制剂开发提供了一定参考依据。