葡萄籽原花青素B2对小鼠肾缺血再灌注损伤模型氧化应激及凋亡的影响

汪志顺 沈 昊 徐长庚 李国灏 郭永连

缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)是指组织或者器官在缺血的基础上恢复血流后，损伤进一步加重，甚至出现损伤不可逆的现象。IRI是临床上最常见的急性肾损伤的病因之一，常见于肾移植、保留肾单位手术，休克等临床疾病的诊治过程中[1]。目前对于IRI的病理生理机制尚未完全研究清楚。现阶段认为其病变过程主要包括细胞能量代谢障碍，氧化应激损伤，钙离子超载，血管内皮细胞损伤，大量炎性细胞浸润，补体激活，细胞的坏死及凋亡等，是由多因素多系统共同参与的复杂级联反应过程[2,3]。目前针对肾脏IRI的保护措施包括缺血预处理、干细胞移植、临床新型药物的使用等[4～6]。但大多数干预方式作用靶点较单一。IRI是多机制共同参与的，各机制间交叉重叠而又协同拮抗。目前很多植物活性成分是天然的抗氧化、抗炎药物，具有多靶点优势，具有良好的研究价值。

原花青素是植物中广泛存在的一大类多酚化合物的总称，它广泛存在于葡萄籽、苹果、松树皮、花生、樱桃等植物中，其中尤其以葡萄籽中含量最为丰富。而葡萄籽原花青素B2(grape seed proanthocyanidin B2, GSPB2)在葡萄籽原花青素中分布最广，抗氧化活性最强[7]。研究表明，GSPB2在胃和十二指肠消化条件下相对稳定，且原花青素B2口服30min后就可以在血浆中检测得到，因而GSPB2具有更好的生物利用度[8，9]。前期研究表明，原花青素B2具有极强的抗氧化应激、清除自由基、抗凋亡等生物活性[10～12]。但GSPB2在肾脏IRI模型中的作用研究甚少。本研究重点探讨GSPB2对小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤过程中氧化应激损伤及凋亡的影响及机制。

材料与方法

1.材料：40只雄性C57BL小鼠购自华中科技大学实验动物中心。GSPB2和鸦胆子苦醇(brusatol, BRU)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL)购自南京诺唯赞医疗科技有限公司。SOD和MDA测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。Nrf-2、HO-1、cleaved-caspase-3一抗均购自武汉三鹰生物技术公司，荧光标记羊抗兔IgG二抗及HRP标记羊抗小鼠二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。

2.模型建立及分组：所有C57BL小鼠均使用苯巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，并行右肾切除术。然后用无损伤血管夹阻断左肾动静脉45min，随后恢复左肾动静脉血流，建立肾脏缺血再灌注模型。建模后24h处死各组小鼠并留取实验标本。所有小鼠随机分成4组，即sham组(n=10，小鼠仅行右肾切除术)、IRI组(n=10，小鼠行右肾切除术，后行左肾缺血45min，再灌注24h)、GSPB2+IRI组[n=10，小鼠在建模前45min腹腔注射GSPB2(30mg/kg)，后行右肾切除术，左肾缺血45min，再灌注24h]和GSPB2+BRU+IRI组[n=10，小鼠在建模前45min腹腔注射GSPB2(30mg/kg)及BRU(10mg/kg), 后行右肾切除术，左肾缺血45min，再灌注24h]。

3.样本收集：造模后24h，采用苯巴比妥钠腹腔注射麻醉，行腹部正中切口，切取左肾，将肾脏组织纵行剖开，一半放入4%多聚甲醛液中固定，另外一半再分成两份，一份用于透射电镜使用，另一份放入冻存管中并放入液氮罐保存。

4.HE染色：将左肾组织用10%中性甲醛溶液固定，按常规石蜡切片制作流程， 梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，切片(厚4μm)，HE染色，光镜下观察。

5.透射电镜：取新鲜1mm3的小块肾组织标本置于2.5%戊二醛电镜固定液固定2h,用1%锇酸4℃再固定，Spurr树脂包埋，LKB1型超薄切片机切片，经枸橼酸铅和醋酸铀双重染色后，在JEM-1200EX透射电镜下观察切片。

6.TUNEL染色：本实验釆用商业化的细胞凋亡检测试剂盒，严格按照试剂盒制造商提供的产品说明书进行操作，并在荧光显微镜下观察采集图像。

7.检测肾脏组织中SOD、MDA水平： 检测各组小鼠肾脏组织中SOD、MDA水平，具体操作严格按照商业试剂盒进行。

8.肾脏组织免疫荧光染色：切片脱蜡至水，处理后的组织切片置于制备的EDTA抗原修复液中进行抗原修复。然后用10%的正常山羊血清在37℃下封闭切片30min。然后加入一抗Nrf-2、HO-1、cleaved-caspase-3，全部在4℃下培养过夜。然后滴加荧光标记羊抗兔IgG二抗，室温孵育30min。并使用DAPI染液染细胞核5min。用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

9.Western blot法检测：从小鼠肾组织中提取和纯化蛋白质。采用SDS PAGE凝胶电泳，然后转移到PVDF膜。用含5% 脱脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室温封闭2h。然后加入一抗Nrf-2、HO-1、cleaved-caspase-3，4℃孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜，再加入相应二抗，室温摇床孵育2h。再用TBST漂洗，ECL显影。

结 果

1.葡萄籽原花青素B2对肾缺血再灌注损伤后的肾脏形态及病理学的影响：HE染色观察发现，与sham组比较，IRI组肾小管上皮细胞的肿胀、坏死及凋亡明显加重。而与IRI组比较，GSPB2+IRI组的肾脏形态学损伤明显减轻。而在GSPB2+ BRU+IRI组中GSPB2干预的保护作用受到了一定程度的抑制(图1)。透射电子显微镜检查显示，IRI组的肾小管上皮细胞线粒体肿胀，线粒体空泡样变性，线粒体嵴断裂或消失等。而GSPB2+IRI组肾小管上皮细胞内线粒体损伤明显减轻。而在GSPB2+BRU+IRI组中GSPB2干预的保护作用受到了一定程度的抑制(图2)。

图1 各组小鼠肾脏的形态及病理改变(HE,×400)A.sham组；B.IRI组；C.GSPB2+IRI组；D.GSPB2+BRU+IRI组

图2 各组小鼠肾脏超微结构及病理改变(透射电镜，×8000)A.sham组；B.IRI组；C.GSPB2+IRI组；D.GSPB2+BRU+IRI组

2.葡萄籽原花青素B2对肾缺血再灌注损伤后肾小管上皮细胞凋亡的影响：与sham组比较，IRI组肾小管上皮细胞的凋亡数量明显增多(图3)。同时，cleaved-caspase-3蛋白在IRI组中的表达水平明显高于sham组(图4、图5)。而与IRI组比较，GSPB2+IRI组肾小管上皮细胞凋亡数量明显减少，且cleaved-

图3 各组小鼠肾脏肾小管上皮细胞的凋亡(TUNEL，×400)A.sham组；B.IRI组；C.GSPB2+IRI组；D.GSPB2+ BRU+IRI组

图4 各组小鼠肾脏组织cleaved-caspase-3蛋白表达(免疫荧光染色，×400)A.sham组；B.IRI组；C.GSPB2+IRI组；D.GSPB2+BRU+IRI组

图5 Western blot法检测各组小鼠肾脏组织cleaved-caspase-3蛋白的表达

caspase-3蛋白表达水平明显降低(图4、图5)。而与GSPB2+IRI组比较，GSPB2+ BRU+IRI组中cleaved-caspase-3蛋白表达水平明显升高。

3.葡萄籽原花青素B2对肾缺血再灌注损伤后SOD, MDA活性的影响：如表1所示，与sham组比较，IRI组、GSPB2+IRI组以及GSPB2+BRU+IRI组小鼠肾脏组织中的MDA的水平均明显升高(P均<0.05)。同时，与IRI组比较，GSPB2+IRI组小鼠肾脏组织中的MDA的水平明显降低，SOD水平明显提高(P<0.05)。而GSPB2+BRU+IRI组小鼠肾脏组织中的MDA的水平又较GSPB2+IRI组明显升高，同时SOD水平明显降低(P<0.05)。

表1 各组小鼠肾脏组织中SOD及MDA的水平

4.葡萄籽原花青素B2对肾缺血再灌注损伤后抗氧化蛋白表达的影响：免疫荧光染色及Western blot法检测结果表明，GSPB2+IRI组中小鼠肾脏组织的Nrf2及HO-1蛋白的表达水平较IRI组明显上调。同时，与GSPB2+IRI组比较，GSPB2+ BRU+IRI组小鼠肾脏组织中Nrf2及HO-1蛋白的表达水平明显下调(图6、图7)。

图6 各组小鼠肾脏组织Nrf2和HO-1蛋白表达(免疫荧光染色，×400)A.sham组；B.IRI组；C.GSPB2+IRI组；D.GSPB2+BRU+IRI组

图7 Western blot法检测各组小鼠肾脏组织Nrf2和HO-1蛋白表达

讨 论

缺血再灌注损伤的病理生理及发病机制涉及多因素，并且错综复杂。目前认为在再灌注阶段可产生大量的活性氧ROS(reactive oxygen species，ROS)，而线粒体越来越多的被认为是这些ROS的关键来源[13]。来源于线粒体产生的过量的超氧化物可以激活多种途径从而导致组织损伤。其中脂质过氧化就可以导致细胞或线粒体的损伤进一步导致ATP(adenosine triphosphate)生成中断，钙离子水平失调，线粒体通透性转换孔开放并随后导致凋亡或坏死的发生[14]。因此，减少线粒体ROS产生或减轻氧化应激损伤，减少肾小管上皮细胞的坏死和凋亡对减轻肾脏组织的缺血再灌注损伤具有重大意义。

正常情况下，肾小管上皮细胞线粒体呼吸可产生ROS，低水平的ROS作为细胞内及细胞间重要的转导信号对于维持肾脏内环境稳定及功能具有重要意义，而过量的ROS则会导致氧化应激损伤，对肾脏组织造成危害[15]。有研究表明，原花青素B2干预能促进Nrf2核易位并对脓毒症相关的急性肾损伤线粒体动力学具有保护作用，同时原花青素B2干预能明显降低小鼠肾脏组织中superoxide (O2-) 和NOX4的水平，提高肾脏组织中抗氧化酶SOD、GSH的水平，同时降低MDA的水平[16]。本研究中比较IRI组，GSPB2+IRI组肾小管上皮细胞线粒体损伤明显减轻，同时小鼠肾脏组织中抗氧化酶SOD的水平明显提高，同时小鼠肾脏组织中MDA的水平明显降低。

为了维持细胞氧化还原稳态，避免有害的氧化应激损伤，由KEAP1(kelch-like ech- associated protein 1)和Nrf2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2)共同组成的内源性抗氧化系统通过调节多种解毒相关基因的表达发挥着重要保护作用[17]。在正常情况下，KEAP1蛋白与Nrf2蛋白在细胞质中结合，Nrf2受到 KEAP1的调控，并经过泛素化降解，使Nrf2维持较低水平。当受到氧化应激刺激时，亲电试剂与KEAP1的半胱氨酸残基加成，诱导KEAP1的空间构象改变，使Nrf2与KEAP1解离，解离后的Nrf2转移至细胞核内与核内的抗氧化反应原件相结合，提高HO-1(heme oxygenase 1)、NQO-1 (NADPH quinone oxidoreductase 1) 等多种抗氧化基因的表达水平[18]。

本研究中，与IRI组比较，GSPB2+IRI组小鼠缺血再灌注损伤肾脏组织中Nrf2和HO-1蛋白的表达水平均明显提高。而当加入Nrf2抑制剂BRU后，GSPB2+BRU+IRI组小鼠缺血再灌注损伤肾脏组织中Nrf2和HO-1蛋白的表达水平较GSPB2+IRI组均明显降低。因此，笔者推测葡萄籽原花青素B2干预可以激活内源性抗氧化系统中Nrf2/HO-1信号通路并提高抗氧化蛋白Nrf2和HO-1的表达水平，从而减轻肾脏缺血再灌注过程中的氧化应激损伤。

在缺血再灌注诱导的急性肾损伤过程中不可避免的存在着内质网应激及细胞凋亡。当内质网受到过量ROS和(或)Ca2+超载等严重应激刺激时，内质网的内稳态受损，从而导致未折叠及错误折叠蛋白质的积聚，这些变化最终可导致细胞凋亡[19]。近年来研究发现，原花青素B2预处理能通过调控Bcl-2/Bax和NF-κB 信号通路从而减少脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞的凋亡[20]。本研究中葡萄籽原花青素B2预处理能明显抑制缺血再灌注损伤肾脏组织中凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3的表达，明显减轻缺血再灌注诱导的肾小管上皮细胞的凋亡。

综上所述，葡萄籽原花青素B2干预能明显减轻小鼠肾脏缺血再灌注过程中的氧化应激损伤及细胞凋亡。这可能与葡萄籽原花青素B2干预能激活内源性抗氧化系统Nrf2/HO-1信号通路有关。本实验初步表明了葡萄籽原花青素B2干预能减轻小鼠肾缺血再灌注损伤，为缺血再灌注损伤的药物防治提供了一定的实验基础。