运动干预下CSE/H2S调控TLR4/NF-κB信号通路对酒精性肝损伤的改善作用

陈 锐， 邵长凤， 屈红林， 陈伊琳， 陈嘉勤*

(1)湖南师范大学体育学院 体适能与运动康复湖南省重点实验室， 长沙 410012；2)宜春学院体育学院理论教研室 江西， 宜春 336000)

长时间大量饮酒是影响酒精性肝损伤疾病发生和发展的重要因素，可造成酒精性肝炎、酒精性脂肪肝、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化和肝细胞癌等肝组织不同病理改变，在临床最严重的表现形式是引起肝功能衰竭甚至死亡[1 , 2]。研究发现，酒精代谢过程中会产生过量自由基参与脂质过氧化代谢，肝细胞抗氧化系统失衡，同时肠道菌群失调和肠道通透性增加等，诱导大量促炎症因子堆积，造成肝细胞炎性损伤[3,4]。深入了解酒精性肝损伤的发生和发展机制，寻找新的干预手段对酒精性肝损伤患者具有重要意义。

研究显示，在生物体或细胞内复杂多样的信号通路中，气体信号分子以传播速度快、连续作用等特点成为研究焦点[5,6]。除NO和CO气体信号分子外，作为哺乳动物体内第3种新型内源性气体小分子，H2S具有不依赖相应质膜受体，可自由渗透胞膜内发挥生物学效应，调控多种生理及病理过程[7]。生理状态下，肝在胱硫醚γ-裂解酶( cystathionine γ-lyase，CSE)、胱硫醚β-合酶( cystathionine β-synthase，CBS)催化下可产生内源性气体分子H2S，参与调节机体氧化应激、炎性反应、脂代谢、细胞损伤等生理和病理过程，在线粒体中以β-巯基丙酮酸为底物催化生成H2S，可抑制炎症介质释放，降低炎症反应。同时，能明显降低肝的脂质蓄积和细胞损伤[8,9]。

目前，有氧运动康复成为改善慢性疾病的主要干预方式之一，主要优势在于易实施、技术简单易接受，且低经济消费。以往的研究表明，形成规律运动习惯且达到相应运动强度，对机体健康可产生良好促进效应，可有效防止脂肪堆积和提高免疫能力等，对多类慢性疾病的预防、康复治疗具有显著效果[10]。而有氧运动是否能通过H2S介导炎性通路改善酒精性肝损伤的研究较少。本研究旨在构建小鼠酒精性脂肪肝模型，通过有氧运动、H2S供体NaHS及H2S生成抑制剂PAG施加干预，探讨有氧运动对酒精性肝损伤的影响及其机制，为运动干预在该类疾病的临床康复应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型构建与分组

实验对象为雄性昆明种小鼠，由湖南斯莱克景达实验动物中心提供(动物合格证号：43004700013147)，体质量为37～41 g，购后于湖南师范大学体育学院体适能与运动康复省重点实验室进行适应性饲养。7 d后，随机分成酒精性脂肪肝病组(alcoholic fatty liver disease, AFLD)[模型组(M)、有氧运动组(E)、有氧运动+NaHS组(EN)、有氧运动+PAG组(EP)]，空白组(K)，每组10只。AFLD组建模第1周，采用含50%乙醇的谷酒王0.1 mL/10 g灌胃，第2周将酒精浓度提升至0.2 mL/10 g 。空白组(K)灌服等体积生理盐水，持续7周。每笼5只，自由进食、饮水。

1.2 运动方案与给药

酒精性脂肪肝模型构建后观察小鼠生活行为及运动能力，在进行正式运动干预前进行1周梯度适应训练。目的在于提高小鼠运动适应能力，适应训练方案：整体分3阶段。第1阶段采用6 m/min×25 min，为期2 d；第2阶段采用8 m/min×40 min，调整跑台坡度至5°，为期2 d；第3阶段采用10 m/min×60 min，坡度调至8°，为期3 d。休息1 d后，保持第3阶段训练方式进行7周正式训练。于每个训练日16点进行，每周训练6 d，休息1 d。有氧运动+NaHS组、有氧运动+PAG组，除运动干预外，根据小鼠与人体体表面积比每天给予腹腔注射0.2 mL(浓度为50 μmol/kg) NaHS溶液、0.2 mL(浓度为40 mg/kg) PAG溶液干预。

1.3 一般行为学观察

运动干预期间观察小鼠生活情况，每隔2周进行称重记录，记录饮食、活动、毛色、肝重及肝体比等情况。

1.4 组织采集

取材前小鼠食物剥夺12 h，腹腔注射 1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉剂，待产生效应后，翻转小鼠，若无翻正反射，剪去眼球周边毛发，采用取眼球法收集血液，2 500 r/min×10 min，收集上层血清，超低温保存，用于肝功能、H2S等相关指标检测。手术刀切取10 mm3肝右叶组织，10%多聚甲醛(0.1 mol/L，pH7.4)固定，进行病理组织结构观察及免疫组织化学染色。另取部分肝右叶组织进行H2S含量测定、相关蛋白质检测、mRNA提取及Illumina高通量测序。

1.5 指标检测及方法

去蛋白质法检测血浆H2S含量，比色法测定谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)、 谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)活性。取肝组织100 mg，加入液氮进行碾磨，吸入等体积RIPA裂解液匀浆，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液-80 ℃保存备用。采用比色法测定肝组织谷胱甘肽(glutathione, GSH)、蛋白质羰基化程度(蛋白质氧化损伤程度指标)，硫代巴比妥酸法检测丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平，化学法检测胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE)活性。

1.6 病理学观察

取备存肝右叶组织，石蜡包埋，切片厚度4 μm，根据肝组织苏木精-伊红染色法步骤操作，观察肝组织病理结构。

1.7 肝组织免疫组化染色及蛋白质检测

另取部分肝右叶切片，置于65 ℃烤箱脱蜡、复水和抗原修复。SABC法检测酒精性脂肪肝小鼠肝组织中TLR4、NF-κB和IL-1β表达情况，苏木素复染、梯度酒精脱水、透明和封片。Simple PCI高性能专业图像分析软件计算各因子阳性表达面积。取备存的肝组织匀浆上清液，采用Bradford法测定TLR4、NF-κB和IL-1β蛋白含量。

1.8 qRT-PCR及高通量测序

1.8.1 肝组织总RNA提取 取20 mg新鲜肝右叶组织。加液氮后碾磨，与1 mL trizol溶液充分混匀，待其室温反应10 min，与0.2 mL氯仿溶液混合并震荡，离心25 min，离心机转速设置12 000 r/min，温度设置4 ℃。去沉淀后，与等体积异丙醇溶液充分混匀，静置反应15 min，高速离心25 min，去除上清液，试管内加适量无水乙醇调配的75%酒精(DEPC处理水稀释)，12 000 r/min离心15 min，反复洗涤3次后保留乳白色沉淀，与40 μL DEPC水混合，轻轻摇晃溶解沉淀，-80 ℃超低温备存。

1.8.2 qRT-PCR 去除基因组DNA反应及反转录试剂盒购买于TaKaRa公司，根据试剂盒操作说明进行。设置总RNA反转录数据：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，10 ℃ 5 min。qRT-PCR：选用仪器ABI 7900HT，试剂盒SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)，根据试剂盒操作说明进行。设置两步法PCR反应扩增数据。Stage1：预变性温度94 ℃ ，反应30 s，Stage 2：PCR反应温度94 ℃ ，时间为3 s；60 ℃ ，时间为30 s，40循环数。检测Toll样受体4(toll-like receptors 4, TLR4)、核转录因子kappa B(NF-κB)、白细胞介素-1β(IL-1β)、胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase, CSE) 的表达。根据GenBank核酸数据库中CSE、TLR4、NF-κB、IL-1βcDNA序列，其引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，因子mRNA相对表达量用2-ΔΔCt表示。

1.8.3 高通量测序 提取E、M、EN、EP组样本肝组织总RNA并进行纯度检测，经富集、mRNA解链、cDNA合成等步骤形成cDNA二链。根据试剂盒操作说明进行操作，纯化、洗脱、修复、扩增和测序。通过DEGseq基因表达开展各组小鼠间结果差异性对比，以∣log2 Ratio∣≥1与q<0.05取表达具有差异性基因。

1.9 数据统计学方法

2 结果

2.1 酒精性肝损伤构建

随酒精毒性积累，肝损伤程度加深，结果如Table 2所示。相比K组(2.41±0.09, 4.06±0.15)，AFLD组肝脂肪系数(3.46±0.07)及脏器系数(5.81±0.11)上升，血清肝功能指标数值上升，GSH含量下降(1.97±0.19)(P<0.01)，结果见Fig.1所示。肝细胞体积增大，肝索紊乱，脂质空泡及炎性浸润明显，胞核呈现畸形或偏移，表明长期的酒精刺激已促使构模小鼠肝功能损伤。

Table 1 PCR primer sequences

Table 2 Results of related biochemical indicators and coefficients of mice in each

Fig.1 Comparison of HE staining of liver tissue of mice in K group and AFLD group The AFLD group was given 50% ethanol 0.1 mL/10 g and 0.2 mL/10 g by gavage for one week, respectively, and the alcohol concentration was maintained for 7 weeks in the second week. The changes in the liver tissue structure of the mice in each group were observed. Red and black arrows indicate nuclear necrosis and lipid droplets, respectively

2.2 一般情况观察

如Table 3所示，相比K组，各组小鼠肝组织脂重、脂肪系数及脏器系数上升(P<0.01或P<0.05)，体质量无显著变化(P>0.05)，表明酒精性脂肪肝小鼠肝组织脂肪重量上升。相比M组，E组、EN组脂肪系数和脏器系数下降(P<0.01)，相比E组，EN组脂肪系数和脏器系数下降，EP组无显著变化，表明有氧运动及给予硫化氢供体NaHS可降低酒精性脂肪肝水平。

Table 3 Fat weight, wet liver weight and correlation coefficient results of mice in each group

2.3 血液及肝组织指标检测

结果如Table 4所示。相比M组，E、EN、EP组AST、ALT、MDA含量下降、蛋白质羰基化程度降低(P<0.01或P<0.05)，GSH和CSE含量增加(P<0.01或P<0.05)；相比E组，EP组AST、ALT、MDA、蛋白质羰基化程度上升，GSH和CSE含量下降。且EN组AST、ALT、MDA、蛋白质羰基化程度低于EP组，CSE含量上升，表明有氧运动可降低酒精性脂肪肝致肝功能损伤，增强硫化氢合成的关键酶CSE含量，且联合硫化氢供体NaHS干预效果更佳。

Table 4 Test results of liver function and related indexes of mice in each group

2.4 不同干预方式对酒精性肝损伤小鼠肝及外周血中H2S含量的影响

结果如Table 5所示。相比K组，M组外周血与肝组织H2S含量上升；相比M组，E组、EN组、EP组外周血与肝组织H2S含量增加(P<0.01或P<0.05)；相比E组，EN组外周血与肝组织H2S含量上升，EP组含量下降(P<0.01)，表明有氧运动联合硫化氢供体NaHS可增加小鼠肝及外周血中H2S含量。

Table 5 The H2S contents in plasma and liver tissue of each group of mice

2.5 肝组织形态学观察

结果如Fig.2显示。与K组比较，M组肝索结构破坏，出现纤维化灶，大量炎性细胞浸润与脂滴空洞，胞核呈畸形扩散、核坏死或核空泡。与M组相比，E、EN、EP组纤维化症状与炎症浸润减轻，存少量小泡样脂滴，坏死面积降低；相比E组，注射NaHS组改善效果更佳，注射PAG抑制剂组可加重肝的病理改变，表明有氧运动可降低酒精性脂肪肝小鼠肝组织脂滴的形成，降低炎性反应，且联合硫化氢供体NaHS干预效果最佳。

Fig.2 Comparison of HE staining results of different groups of mice After 7 weeks of aerobic exercise or combined intraperitoneal injection of sodium hydrogen sulfide enhancer (50 μmol/kg, 0.2 mL) and PAG inhibitor (40 mg/kg, 0.2 mL), the changes in liver tissue structure of mice in different groups were observed; Red, yellow and black arrows indicate vacuoles, nuclear necrosis and lipid droplets, respectively

2.6 免疫组织化学染色观察与分析

研究结果见 Fig.3与Table 6所示。M组TLR4、IL-1β、NF-κB因子阳性表达最高，与M组比较，E、EN、EP组各因子阳性表达减少(P<0.01或P<0.05)，与E组比较，EN组各因子阳性表达减少(P<0.01)，EP组表达上升(P<0.05)，表明有氧运动干预下可降低酒精性脂肪肝小鼠肝组织TLR4/NF-κB通路中相关炎性因子的蛋白质含量，且联合NaHS干预效果更佳，而硫化氢生成抑制剂PAG的干预可升高相关炎性因子的含量。

Fig.3 The results of immunochemical staining of liver tissue in different groups After 7 weeks of different intervention methods, the expression levels of related proteins in the liver tissue of mice in each group were observed by immunohistochemical staining. Values are the mean ± SD of 10-sample assays, and the areas of positive expression of relevant factors are shown in Table 6

Table 6 Comparison of positive expression areas of liver-related factors in mice of each group

2.7 肝组织相关因子蛋白质检测

结果如Fig.4所示。与M组比较，E、EN、EP组各因子蛋白质含量减少(P<0.01)，与E组比较，EN组各因子蛋白质含量下降，EP组各因子蛋白质含量呈现上升(P<0.05)。

Fig.4 Comparison of protein content of liver tissue-related factors in different groups of mice After aerobic exercise combined with intraperitoneal injection of sodium hydrosulfide enhancer (50 μmol/kg, 0.2 mL) and PAG inhibitor (40 mg/kg, 0.2 mL) for 7 weeks, changes in the protein content of liver tissue-related factors of mice in each group were detected. Values are the mean ± SD of 10 samples.**P<0.01, compared with K group;##P<0.01, compared with M group.&P<0.05, compared with group E

2.8 高通量测序分析

检测结果见Fig.5所示。各组小鼠肝组织差异基因的整体分布情况，红点表示上调，绿点表示下调。M组与E组比较，共11 713个基因表达存在差异。其中，8 649个表达上升，3 064个表达下降。在Toll样受体抑制后诱发，多数基因与炎症反应相关；EP组与E组比较，共4 932个基因表达存在差异。其中，722个表达上升，4 210个表达下降，多数基因与细胞增殖分化的调控及炎症有关；EN组与E组比较，共1 295个基因表达存在差异。其中，454个表达上升，841个表达下降，相关基因主要与细胞损伤修复和心血管神经变性的相关蛋白质抑制剂有关。

Fig.5 Volcano plot of differentially expressed genes in liver tissue of mice in different groups The abscissa is the expression fold of different experimental groups/different samples, the ordinate is the statistical significance of the expression change. Red indicates up-regulated genes, green indicates down-regulated genes, and gray indicates unchanged genes

2.8.1 肝组织差异表达基因的 GO 统计 由Fig.6显示，肝组织差异表达基因富集的显著水平可知，差异表达基因中有294个基因富集于374条GO terms中，下调基因176个，在207条GO terms富集，108条富集于BP，50条富集于CC，149条富集于MF；上调基因118个，在57条GO terms富集，31条富集于BP，8条富集于CC，18条富集于MF。各组对比分析显示：主要有Bcl-2、Nfkbid、NF-κB、MOX44、CTSK、ACK1、IL-1β、S1pr1、Ceacam1等9个基因具显著差异，与细胞免疫应答、细胞分化、纤维化信号转录和细胞杀死等有关。涉及运动调控GO terms中，含20个基因，有NFKBID、BNIP、BMF、L-RR-8、CD209、Bcl-2和BMF等，BMF是诱发细胞损伤或凋亡的重要蛋白质；NFKBID可介导NF-κB促进IL-2、TNF-αD等炎性细胞因子的释放。可见，模型组上调基因中大多参与肝组织免疫细胞的应答，且与运动关系密切。

Fig.6 Histogram of GO statistics of differentially expressed genes in liver tissue The horizontal axis represents the specific term of the three basic GO categories BP, CC or MF. The vertical axis represents the number of genes annotated to a term, red represents the number of up-regulated expression, and green represents the number of down-regulated expression

2.8.2 肝组织差异表达基因的KEGG通路分析 实验对3个比较组中KEGG相关通路(pathway)应用超几何检验进行富集分析，找出差异表达基因显著性富集的通路。红色表示上调差异基因注释在KEGG Orthology(KO)上，该KO显示为上调。反之，绿色表示该KO下调。分析发现，部分差异表达基因显著富集的KEGG通路包括：肝纤维化、炎性通路、脂肪消化吸收、色氨酸代谢、胰岛素分泌、PPARs、甘油糖新陈代谢、氧化应激等多种代谢信号调节通路。与机体脂肪酸代谢、血脂异常、脂肪组织细胞代谢密切相关。经过比较发现，给予有氧运动及硫化氢供体NaHS可促进肝组织脂肪氧化，同时降低脂肪蓄积。

2.9 不同干预方式对TLR4/NF-κB信号通路相关因子的基因水平表达

研究结果正如Fig.8所示：相比M组(1.04±0.08)，E组(1.82±0.13)、EN组(2.11±0.18)CSEmRNA表达上升，TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA表达下降(P<0.01或P<0.05)；相比E组，EN组CSEmRNA表达增加，TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA表达降低(P<0.01)，EP组(1.12±0.11)CSEmRNA表达下降，TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA表达升高(P<0.01)，表明有氧运动可促进酒精性脂肪肝小鼠肝组织中CSE的基因水平，降低TLR4/NF-κB信号通路相关炎性因子的表达，联合NaHS干预效果更佳，联合PAG干预可降低CSE的基因水平，促进炎性因子的表达。

Fig.7 KEGG enrichment results of related signaling pathway differential genes The hypergeometric test was used to analyze the enrichment of each pathway in KEGG. It was found that the differentially expressed genes were significantly enriched in the immune and lipid metabolism pathways, such as TNF-α, PI3K-AKT, PPARs and FAT signaling pathway. Red indicates up-regulated genes, and green indicates down-regulated genes

Fig.8 Gene expression results of liver tissue-related factors in mice in each group After 7 weeks of aerobic exercise combined with intraperitoneal injection of sodium hydrosulfide enhancer (50 μmol/kg, 0.2 mL) or PAG inhibitor (40 mg/kg, 0.2 mL), the gene expression of liver tissue-related factors in mice in each group was detected. Values are the mean ± SD of 10-sample assays,**P<0.01, compared with K group;##P<0.01, compared with M group;&&P< 0.01, compared with E

3 讨论

3.1 酒精性肝损伤小鼠激活TLR4/NF-κB信号通路轴诱发炎症

酒精滥用和酒精依赖已成为当今一个重要的公共卫生问题。大部分酒精经肠胃吸收入血，通过血液循环在肝内发生氧化反应，但过量饮酒会导致肝组织脂代谢障碍和生成脂肪酸，肝细胞内脂肪滴蓄积，形成脂肪肝[11, 12]。随时间推移，肝细胞出现局灶性坏死，促使免疫细胞大量释放非组蛋白染色体结合蛋白质，致肝内炎症爆发[13]。同时，肝的内质网应激使IRE1α激活，造成IκBα磷酸化及NF-κB核易位，或由TNF-α、IL-1诱导Ser32/36上的IKK使IκBα磷酸化，促使p50/p65NF-κB二聚体进入细胞核，并激活基因转录诱发炎症[14, 15]。El-Dessouki 等[16]发现，他莫昔芬诱导的肝损伤中，NF-κB基因可对肝细胞生长和炎症反应进行负反馈调控，参与肝的脂质生物合成与运输或诱导细胞凋亡，抑制其表达可减轻肝细胞损伤。Mazur-Bialy 等[17]发现，运动时可促进肌肉释放鸢尾素激素，降低TLR4和MyD88蛋白质水平和NF-κB磷酸化作用，促炎因子关键蛋白质释放抑制。本文中，发现模型组小鼠肝组织增重、脏器系数增高，肝功能指标、蛋白质羰基化程度上升，血清H2S及肝组织CSE含量降低。肝组织显微结构发现，炎性细胞浸润及脂滴空洞，TLR4、IL-1β、NF-κBmRNA表达上升。提示酒精的过量摄入会致使肝脏脂肪蓄积及炎症浸润，可能与TLR4的激活促进下游NF-κB等炎性通路，介导下游炎性信号因子的活化有关。

3.2 有氧运动干预下CSE/H2S体系介导TLR4/NF-κB途径的抗炎效应

有氧运动对炎症的改善作用已被证实，但有氧运动拮抗酒精性肝损伤炎症的信号传导机制很大程度上仍是未知的。H2S是机体内源性信号传导的气体递质，主要由巨噬细胞中CSE合成，在炎症中发挥核心作用，正成为炎症中的新型调节剂[18]。Zheng 等[19]通过细胞研究发现，脂多糖(LPS)刺激后可经TLR4-p38依赖性和TLR-4-NF-κB依赖性途径增进炎性反应，同时刺激使巨噬细胞中CSE和H2S的生物合成增加拮抗炎症；Benedetti 等[20]发现，促炎剂发酵支原体通过Toll样受体介导的NF-κB活化来诱导促炎细胞因子MCP-1表达，而CSE/H2S可介导TLRs/NF-κB途径减轻其炎症。本文发现，CSE/H2ST体系可能通过介导TLR4/NF-κB信号途径，参与有氧运动拮抗小鼠肝炎性损伤的转归过程。相比M组，E组小鼠CSEmRNA表达水平，H2S含量上升，TLR4/NF-κB途径受到抑制，炎性反应减轻。结合肝功能指标、蛋白质羰基化程度下降结果，肝细胞脂滴样变减轻，损伤症状降低。测序结果显示，有氧运动干预与CSE/H2S介导的TLR4/NF-κB炎性传导途径有着紧密联系，提示有氧运动可升高肝组织CSE表达，促进H2S的合成。高表达的CD14可结合于LPS/LBP，介导LPS对细胞的刺激作用，激活单核细胞等分泌TNF、IL-1等细胞因子，介导一系列生理(免疫反应性强化)和病理(炎症)反应，其可能的机制是有氧运动促进CSE/H2S体系的高表达，并介导TLR4/NF-κB传导途径的抑制，从而减轻炎症反应过程。

3.3 H2S干扰下联合有氧运动干预TLR4/NF-κB途径的抗炎效应

为进一步确定有氧运动干预下CSE/H2S的高表达对肝损伤中TLR4/NF-κB介导的先天免疫信号转导影响，本文采用注射H2S供体(NaHS)及抑制剂(PAG)对H2S的生成进行干扰。Tamizhselvi等[21]发现，急性胰腺炎小鼠在注射H2S抑制剂PAG后，可消除TLR4、IL-1受体相关激酶4、肿瘤坏死因子受体相关因子(CD120a、TNFRSF1A)和NF-κB的低表达水平，加重胰腺组织炎性损伤；注射NaHS后可降低TLR4/NF-κB炎性途径相关因子表达，减轻炎性损伤。Han等[22]发现，PAG可降低CSE、H2S含量，增加TNF-α、IL-10表达水平，但NaHS给药可进行逆转。本文中，有氧运动干预后，TLR4、NF-κB、IL-1βmRNA表达下调，对比分析E组与EN组、EP组可知，下调机制与肝组织CSE基因高表达及H2S含量升高密切相关，进行NaHS给药可提升机体H2S含量，炎症反应的拮抗效应增加，降低肝组织脂滴样病变及炎性浸润；给药PAG可逆转有氧运动对肝组织炎症及损伤的改善效应，肝组织脂滴蓄积与损伤增加。结果表明，有氧运动对酒精性肝损伤肝功能的恢复、脂肪蓄积及炎症反应有明显改善作用，可能与H2S介导的抑制TLR4/NF-κB炎症传导途径有关，且联合NaHS给药干预效果更佳。

CSE/H2S气体信号体系对酒精性肝损伤后小鼠肝组织炎症有重要调控作用，7周有氧运动可促进CSE/H2S体系，从而抑制肝组织TLR4/NF-κB信号通路以及下游相关炎性因子的表达，减弱小鼠肝组织炎性损伤及肝的脂质变性，且有氧运动结合外源性硫化氢供体NaHS给药干预效果更佳。