儿童免疫性血小板减少症淋巴细胞亚群及血小板相关抗体变化的临床意义*

陈诗杨，罗小娟，付笑迎，易梦，彭冬，邝雅贤，陈运生（.汕头大学医学院，广东汕头 55000；2.深圳市儿童医院a.检验科b.血液肿瘤科，广东深圳 58038）

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是以外周循环血小板减少、黏膜出血为主，伴或不伴有内脏器官出血的自身免疫病，一般常以病毒感染作为诱因，也可能会存在遗传易感性或者环境损伤等因素，儿童多发病，临床主要以排除性诊断来确诊该病［1］。ITP 发病机制不明，常用的ITP 实验室检测手段有血常规、骨髓细胞形态学检查和免疫病相关的病原学检查等，其中流式细胞术因为敏感性和特异性较高，其项目如血小板相关免疫球蛋白抗体（platelet associated immunoglobin，PAIg）如PAIgG、PAIgM、PAIgA 和外周血淋巴细胞亚群检测等也较常作为辅助诊断应用于临床。本研究对既往来我院初诊为ITP 患儿进行了外周血淋巴细胞亚群和血小板相关抗体（PAIgG、PAIgM、PAIgA）的回顾性分析，观察其发病初期时血小板相关抗体阳性率和淋巴细胞亚群比例的变化规律，为临床诊断提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2020 年6 月至2021 年6 月在深圳市儿童医院确诊为ITP 的患儿98 例进行回顾性分析。纳入标准为：诊断标准符合《儿童原发性免疫性血小板减少症诊疗规范（2019 年版）》［2］。排除标准为：以血小板减少为首发的再生障碍性贫血、骨髓增生性疾病和恶性血液病等导致的继发性血小板减少。ITP 患儿中，男43 例，女55 例，中位年龄为3.8岁；同时选取30例健康儿童，其中男11例，女19 例，中位年龄为4.4 岁。初次确诊的ITP患儿均未使用药物治疗。

1.2 主要仪器与试剂 BriCyte E6 流式细胞仪及配套淋巴细胞亚群检测试剂盒、溶血素、磷酸盐缓冲液（PBS）（深圳迈瑞公司）；血小板相关抗体检测试剂包括异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗人IgG、IgM、IgA 及同型阴性对照（美国SouthernBio-tech公司）；藻红蛋白（PE）标记的CD41抗体（美国Beckman Coulter公司）。

1.3 方法

1.3.1 淋巴细胞亚群检测 采集2 mL 外周血，EDTA-K2抗凝，分别标注T 管和B／NK 管，在相应的检测管分别加入10 μL T系检测抗体和B／NK系检测抗体，每管再加入25 μL 全血标本，混匀并避光温育15 min后，加入225 μL溶血素，混匀避光温育15 min后上样。

1.3.2 血小板相关抗体检测 取2 mL EDTA-K2抗凝的外周全血标本，混匀并150×g 低速离心10 min，取富含血小板的血浆400 μL 加进流式管内，再500×g离心10 min，弃上清液，用PBS反复清洗3 次。将血小板调整至合适浓度，加入12 μL CD41-PE抗体，混匀后平均分至4 个标记好的流式检测管内，再分别各加入5 μL PAIgG-FITC、PAIgM-FITC、PAIgA-FITC及同型阴性对照，混匀避光温育15 min后每管加入200 μL PBS上机检测。

1.4 统计学分析 用SPSS19.0统计软件进行。不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，采用Mann-Whitney U检验进行统计分析。淋巴细胞亚群及血小板相关抗体表达情况与血小板数量的相关性采用Spearman 检验，治疗前后血小板相关抗体的变化采用Wilcoxon 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。采用二元回归分析建模及ROC 曲线评价2种方法的诊断意义。

2 结果

2.1 外周血淋巴细胞亚群与血小板相关抗体水平 ITP 患儿外周血PAIgG、PAIgM、PAIgA 抗体均高于健康儿童，差异有统计学意义（P＜0.01），淋巴细胞亚群中CD16+CD56+NK细胞比例低于健康儿童，差异有统计学意义（P ＜0.05），CD3+T 细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T 细胞、CD19+B 细胞、CD3+CD16+CD56+NKT细胞比例与健康儿童相比差异均无统计学意义（P 均＞0.05）。ITP 患儿血小板相关抗体中PAIgG、PAIgM、PAIgA抗体阳性率与血小板计数呈负相关（r 分别为-0.284、-0.458、-0.466，P均＜0.01）。而淋巴细胞里各亚群的百分比例变化与血小板下降的趋势无相关性。见表1。

表1 ITP 患儿与健康儿童血小板相关抗体、淋巴细胞亚群的结果比较

2.2 ITP 患儿治疗前后血小板相关抗体变化情况 ITP 患儿治疗好转后血小板相关抗体PAIgG、PAIgM、PAIgA相比治疗前表达下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 治疗前后24例ITP 患儿血小板相关抗体的变化

2.3 血小板相关抗体与CD16+CD56+NK细胞亚群对ITP 的诊断意义 血小板相关抗体（PAIgG、PAIgM、PAIgA）的ROC 曲线下面积（AUCROC）分别为0.735、0.910、0.864，其cut-off 值分别为8.16%、21.5%、5.55%；淋巴细胞亚群中CD16+CD56+NK细胞的AUCROC为0.630。利用二元回归分析建模联合诊断发现，CD16+56+NK 细胞无法被纳入模型。一般认为AUCROC值在0.7 以上时诊断价值较高，CD16+CD56+NK 细胞在ITP 的诊断价值方面低于血小板相关抗体，二者联合诊断并不能提高诊断效能。3种血小板相关抗体的比较中，以PAIgM 在ITP 中的诊断价值最高，见表3。

表3 ROC曲线评价血小板相关抗体和NK 细胞亚群的诊断情况

3 讨论

ITP 是一种以血小板在体内加速清除或生成减少为特征的获得性自身免疫性出血性疾病，目前认为体液和细胞免疫或许联合介导了ITP 的发病机制［1，3］。本研究结果显示，ITP 患儿血小板相关抗体阳性率明显升高，而淋巴细胞亚群CD16+CD56+NK细胞比例明显低于健康儿童，提示其存在一定程度的免疫紊乱。相比较于ITP 之前的排除性诊断，血小板抗体类的检测近几年被广泛应用于临床作为辅助诊断。本研究发现ITP 患儿治疗前的3种血小板相关抗体水平均高于健康儿童，且存在PAIg阳性率与血小板计数呈负相关、治疗有效后抗体表达下降的情况，与国内研究结论一致［4］。有研究认为儿童ITP 初发生时外周循环血主要是以PAIgM为主，PAIgM 还与患儿年龄、免疫活化及ITP 的自然恢复相关［5］。本研究也通过ROC曲线的绘制发现PAIgM在4 种检测指标中预测价值最高。也有研究发现血小板相关抗体的高水平表达会影响血小板减少症的疗效和恢复，且同时存在2种以上相关抗体阳性的患儿预后会比单纯只有一种抗体的患儿差，治疗后有效组的抗体阳性率也会低于治疗前［6-7］，说明血小板相关抗体在临床诊断和预后判断方面有提示作用。

本研究对ITP 患儿淋巴细胞亚群分析发现，NK细胞比例明显低于健康儿童，差异有统计学意义，与国外的研究结论相似［8］。NK 细胞主要表现为对病毒感染后细胞或者癌变细胞等具有显著的细胞毒性及杰出的细胞因子产生能力［9-11］，研究证实NK细胞在初诊为ITP 时和治疗完全缓解后其比例显著低于健康儿童组，且治疗有效组NK 细胞比例要显著高于难治组，这提示了NK细胞在免疫治疗好转后数量会有所恢复［12］，故NK细胞在ITP 患儿体内的比例失衡可能是介导ITP 发生的原因之一。但是本研究通过ROC 曲线对NK 细胞在ITP的诊断作用中发现其AUCROC仅为0.630，敏感性和特异性并不高，且无法纳入二元回归模型，结合T、B淋巴细胞比例与健康儿童相比差异无统计学意义，说明淋巴细胞亚群在ITP 的发生时虽然存在免疫紊乱，但是用于ITP 的诊断价值有限。

综上所述，ITP 患儿存在一定程度的免疫紊乱，相对于淋巴细胞亚群而言，血小板相关抗体对其诊

断及预后评估更具有临床价值。