基于微流控芯片的实时荧光定量PCR 技术快速检测血小板制剂细菌污染*

俞露，贺云蕾，邓刚（宁波市中心血站输血研究所，浙江 宁波 315000）

目前采供血机构最常用的检测血液及血制剂细菌污染的方法是基于血培养的BacT／ALERT 3D自动化系统［1-2］。该法成本高，耗时长，在诊断时效性上存在明显欠缺［3］；此外，敏感性不高，对于某些难以培养的细菌容易产生假阴性结果［4］。用实时荧光定量PCR（FQ-PCR）技术检测血小板制剂中的细菌16S rDNA并评价血小板制剂的细菌污染情况是一种成熟的细菌检测手段［5-6］。随着FQ-PCR 技术的成熟，逐渐有取代传统方法的趋势，但提取、扩增及检测等步骤既费时又费力，而用微流控芯片进行相关检测可大大简化操作步骤、提高检测效率。微流控FQ-PCR芯片的反应室刻蚀在硅片中，体积约为几微升，加热器也直接集成在芯片上，在相同扩增效率下，微流控FQ-PCR 芯片系统与传统的荧光定量PCR仪相比，其热循环效率快2 ～10倍。而流动式FQ-PCR 芯片系统的发明则进一步提高了PCR芯片的热循环速度。芯片下面有2 个甚至3个不同的恒温区间，当样品流经时就会实现自动变温，在流动中完成变性、退火和延伸反应，达到PCR扩增的目的。微流控芯片完成一个完整的40 循环扩增仅需17 min，而传统FQ-PCR平均耗时1.5 h，在检测速度上更显优势。本研究基于微流控芯片的FQ-PCR技术，快速检测血小板制剂细菌污染。

1 材料与方法

1.1 菌株与血小板标本 金黄色葡萄球菌（Staphylococeucus aurs，ATCC25293）、铜 绿 假 单 胞 菌（Pseudomonas aeruginosa，2265）均由本实验室保存。机采血小板标本采自健康献血者。健康献血者符合《献血者健康检查要求》，且近期未服用抗生素类药物。

1.2 仪器与试剂 恒温摇床（上海一恒科学仪器公司）；生物安全柜（上海力申科学仪器公司）；分光光度计（德国Eppendorf 公司）；超微量分光光度计（美国DeNovix 公司）；核酸提取仪及细菌DNA提取试剂盒（西安天隆科技公司）；微流控芯片检测平台及Real-time FQ-PCR反应预混体系（杭州比芯生物公司）。芯片（杭州比芯生物公司）由聚碳酸酯（PC）和聚乙烯（PE）材料制作而成，左右分为2列，每列8通道，每通道包含一条U型毛细管道，体积为8 μL，可同时检测16个PCR反应。

1.3 细菌污染血液模拟标本的制备 分别挑取金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌单菌落接种于LB液体培养基中，在含氧条件下，37 ℃、180 r／min 顺时针水平旋转培养。增菌至A600nm＝0.5后，将一定浓度的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌液标本分别吸取5 mL，1 000×g离心5 min后弃去上清液，再将沉淀细菌混匀后与1 mL无菌机采血小板浓缩液混合，以此作为细菌污染初始浓度。进一步以无菌机采血小板浓缩液进行10 倍梯度稀释，模拟成浓度为102～108CFU／mL细菌污染的血液标本。

1.4 细菌计数及细菌基因组DNA的提取 取梯度稀释的血液标本涂布细菌计数平板，每个浓度设3个重复，每板各涂布100 μL，37 ℃培养48 h后计算菌落形成单位（CFU）。将上述模拟各细菌污染初始浓度标本分别进行细菌基因组DNA的提取。同时另取1 mL未接入细菌的机采血小板浓缩液作为空白对照。使用超微量分光光度计测定核酸浓度，留取质量达标的DNA（A260nm／A280nm值在1.8 ～2.0之间，A230nm／A260nm值小于0.7）于-20 ℃保存备用。

1.5 FQ-PCR引物 FQ-PCR引物与探针均委托华大基因公司合成，引物序列见表1，扩增片段约200 bp。

表1 16S rDNA探针和引物序列

1.6 微流控芯片FQ-PCR FQ-PCR 反应体系为8 μL，组 成 如 下：2 × mix 4 μL，上、下 游 引 物（10 μmol／L）各0.4 μL，Taqman 探针（10 μmol／L）0.4 μL，去离子水2.4 μL，DNA 模板0.4 μL。将配制好的检测体系灌入芯片的反应槽中，用硅胶垫封闭进口和出口，放置于专用仪器进行PCR 反应和荧光数据收集。条件设置如下：97 ℃预变性8 s；97 ℃7 s，60 ℃14 s，扩增40循环，在60 ℃进行单点荧光检测。

1.7 检出限评价 将已提取的细菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，并分别进行荧光定量PCR反应。每个梯度重复8次实验，7次以上阳性者为有效检测浓度，以最低有效检测浓度作为最低检出限。

1.8 特异性评价 为了评估此次实验中16S rDNA引物和探针的特异性，本次实验选取金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表。所有标本均混合含有人类基因组DNA，利用空白对照可直接评价体系的特异性，当空白对照与细菌最低灵敏度浓度的Ct 值之差越大，特异性越好。根据1.7 得到的检出限数据，选择2个菌种的最低检出限浓度进行检测，同时设置空白对照和以无菌水作为模板的阴性对照，每个菌种均统计10个空白对照的Ct 值，并计算与该细菌最低检出限浓度的Ct值之差。

1.9 重复性试验 将已提取的细菌基因组DNA进行10 倍梯度稀释后进行重复性试验，每个稀释度重复检测15 次，通过计算Ct 值的差异来验证FQ-PCR系统的准确性与稳定性。重复性指数公式为（n 为测量次数，xi为每次测试的结果，为均数）。

1.10 统计学分析 采用GraphPad Prism 6.01 软件统计作图，实验结果以±s表示，用成组配对t检验比较实验组（最低检出限浓度）和空白对照组的检测结果差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检出限评价及标准曲线的确定 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌液的起始浓度分别为8.65×106CFU／mL和8.85×107CFU／mL。通过连续稀释2种细菌的基因组DNA，并进行微流控FQ-PCR，根据各反应管所测得Ct 值（X）与菌液浓度对数值（Y）之间的对应关系，得到所检测细菌（金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌）的标准曲线：Y1＝-0.284 3X+13.467（R2＝0.995 4），Y2＝-0.321 7X+13.747（R2＝0.993 7）。对于血小板的金黄色葡萄球菌污染，该方法的检测灵敏度为865 CFU／mL，而对铜绿假单胞菌的检测灵敏度为885 CFU／mL。

2.2 特异性评价 分别以金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌作为阳性参照评估该体系中16S rDNA引物和探针的特异性，此探针和引物对阳性参照均有反应，与空白对照（人类基因组）无反应（Ct 值均＞38）。当金黄色葡萄球菌含菌量为865 CFU／mL，铜绿假单胞菌含菌量为885 CFU／mL时，最低检出限的Ct值分别为34.97±1.07、37.13±0.93，各统计10个空白对照的Ct 值（阴性结果Ct 值按40 计算），分别为39.32±0.89、39.16±0.92，最低检出限的Ct值与空白对照的Ct值差异有统计学意义（t值分别为4.748、4.887，P均＜0.05）。计算空白对照与细菌阳性标本Ct 值的差，结果分别为4.35±1.01、2.03±0.61。

2.3 重复性试验 根据重复性计算公式，以各浓度菌液提取的DNA进行FQ-PCR扩增后的Ct值计算重复性指数，见表2。

表2 微流控FQ-PCR芯片体系的重复性评价结果

3 讨论

血液和血液制剂的微生物污染是影响输血安全的重要因素之一［7］。血小板更易受细菌污染且造成的临床危害也更严重，主要是因为血小板必须在22 ℃振荡培养的条件下以保持其活性，这也为大部分病原菌提供了优质的生存环境。

在微流控芯片系统上应用特异性荧光探针的FQ-PCR技术对血小板制剂中的细菌16S rDNA 进行检测，对混有更多人类基因组的单采血小板标本而言，其方法的特异性尤其重要，一方面PCR产物要尽可能短以适应快速变温反应，另一方面也要保证序列的保守性，没有交叉反应。当空白对照与细菌阳性最低检出限标本的Ct 值之差越大，特异性越好，即检测灰区越小，该差值在各个菌种中大小不同。本研究中金黄色葡萄球菌的该差值大于铜绿假单胞菌，可见本方法对金黄色葡萄球菌的检出准确性更高。

微流控FQ-PCR 芯片系统在实际应用中还有一些不足：首先灵敏度和重复性仍然达不到传统FQ-PCR仪的程度，这也可能是这类小成本仪器的内伤，仪器性能受到某些硬件（如光源）和仪器体积的限制；其次是通量问题，目前的芯片和仪器不管是大通量设计还是小通量设计，在实际应用中还是显得不太灵活，建议芯片设计小通量化，仪器设计模块化；最后是一体化程度问题，目前市面上的微流控芯片系统基本都是和核酸提取步骤分离的，也有机构成功研制集成核酸提取的PCR 芯片的检测分析系统［8］，未来在检测效率上还有进一步提高的空间。