液相色谱串联质谱技术在病原菌鉴定中的初步应用*

张丽杰，张璐，杜燕华，肖迪，郑翠影，黄印启，冯忠军，Cheng Keding（.河北医科大学第三医院检验科，石家庄 05005；2.河南省疾病预防控制中心a.免疫预防与规划所，b.传染病所，郑州 45006；.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，感染性疾病诊治协同创新中心，北京 02200；4.加拿大国家微生物实验室，加拿大公共卫生署，加拿大温尼伯 RE R2；5.曼尼托巴大学医学院人体解剖与细胞科学系，加拿大温尼伯 RE 0T5）

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）能快速简便地鉴定病原菌［1］，但无法精准区分大肠埃希菌与志贺菌以及奈瑟菌属的某些种。表现型和致病性差异显著的大肠埃希菌与志贺菌在基因组水平有着高度的同源性和相似性［2-4］，因此二者在MALDI-TOF MS技术中呈现出相同的肽质量指纹谱［5-6］而无法得到精准区分。此外，在临床工作中，奈瑟菌属细菌也需要精确鉴定至种，因为人源性奈瑟菌属中除了淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌是致病菌外，其他种的奈瑟菌均被认为是环境中存在的菌，而使用MALDI-TOF MS技术进行鉴定往往会得出错误结论。因此，有必要寻找精准区分大肠埃希菌和志贺菌、精确鉴定脑膜炎奈瑟菌等病原菌的新技术。

液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS／MS）技术因其准确性和高效性而被应用于病原菌鉴定和分型。多项研究结果显示，基于氨基酸序列水平的LC-MS／MS技术通过解析样品的二级质谱，展现了较好的识别细菌、确定型别和鉴定毒素的能力［7-15］。本研究应用LC-MS／MS技术鉴定41株标准菌株以及临床分离的22株奈瑟菌和46 株大肠埃希菌，并以13 株标准菌株观察该技术的线性，初步评估该项技术在病原菌鉴定方面的准确性，为该技术临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 选取大肠埃希菌、志贺菌、奈瑟菌、李斯特菌、沙门菌及葡萄球菌等标准菌株和临床菌株作为LC-MS／MS技术的测试对象。标准菌株41株，包括以下菌株。（1）奈瑟菌属标准菌株7株：Z群脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides，group Z）ATCC35562，B 群脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides，group B）ATCC13090，C 群脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitides，group C）ATCC13102，多糖脑膜炎奈瑟菌（Neisseria polysaccharea）NCTC11858、NCTC15883，灰色脑膜炎奈瑟菌（Neisseria cinerea）NRC31006、87004；（2）大肠埃希菌（Escherichia coli）标准菌株9 株：EDL933、EC211、EC214、090414、871215、 ATCC700926、 ATCC25922、 902380、ATCC47076；（3）志贺菌属标准菌株10 株：鲍氏志贺菌（Shigella boydii）3 株，福氏志贺菌（Shigella flexneri）3 株，痢疾志贺菌（Shigella dysenteriae）3株，宋内志贺菌（Shigella sonnei）1株；（4）沙门菌属标准菌株3 株：肠沙门菌肠炎亚种汤普逊血清型（Salmonella enterica subsp.enterica serovar thompson str.）1株，肠沙门菌肠炎亚种鼠伤寒血清型（Salmonella enterica subsp.enterica serovar typhimurium）1株，肠沙门菌肠炎亚种肠炎血清型（Salmonella enterica subsp.enterica serovar enteritidis）1株；（5）弓形菌属的斯氏弓形菌（Arcobacter skirrowii）CCUG10374；（6）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）标准菌株4 株：ATCC13565、ATCC14458、ATCC19095、ATCC25923；（7）李斯特菌属标准菌株7 株：单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）NCTC5214、1132，威 氏李 斯 特 菌（Listeria welshimeri）ATCC35897，格 式 李 斯 特 菌（Listeria grayi）ATCC19120，伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii）ATCC19119，斯 氏 李 斯 特 菌（Listeria seeligeri）ATCC35167，无 害 李 斯 特 菌（Listeria innocua）ATCC33090。所有菌株均储存于加拿大国家微生物实验室。68株临床菌株最初来源为加拿大各省疾控中心。菌株均由加拿大国家微生物实验室经Vitek 2 Compact传统生化反应鉴定及16S DNA测序进行鉴定并反复验证［7-15］。使用血清学方法对志贺菌和大肠埃希菌进行血清型别的鉴定。

1.2 主要试剂与仪器 1.5 mL低粘附离心管（Diamed公司），碳酸氢铵（Sigma公司），质谱级Pierce胰蛋白酶（货号：90058，Thermo Fisher 公司），甲酸（Fisher公司）；截留分子量为30 的自旋过滤器（Millipore公司）。液相色谱-线性离子阱-轨道阱质谱联用仪LTQ-Orbitrap XL 系统（Thermo Fisher公司），Bruker MALDI Biotyper TOF 系统（德国Bruker Dalton公司），0.3 mm×5 mm C18预柱（Thermo Fisher公司），C18纳米LC柱（Proxeon公司）。

1.3 细菌培养、胰酶消化及LC-MS／MS 检测上机样品准备 接种实验菌株于羊血胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）培养基上，37 ℃过夜培养至肉眼可见的单个菌落。使用200 μL 吸头尖端挑取单个克隆，然后置入含50 μL双蒸水的1.5 mL低粘附离心管中旋转搅动，颠倒混匀并低速离心以确保细菌完全溶解。用100 mmol／L碳酸氢铵溶解胰酶至终浓度为100 μg／mL，快速混匀并取50 μL 加入上述含有细菌的离心管中，37 ℃消化1 h 后，快速离心并吸取100 μL上清液置于已被10 μL 1%甲酸湿润处理过的过滤器上，以10 000×g 离心10 min，收集过滤物作为原始样品。为避免上样量过多而导致后续柱子的堵塞及携带污染，原始样品根据其最初菌落大小进行相应的稀释，方法参见文献［9］。完整菌落全部置于1.5 mL 低粘附离心管进行消化后，菌落直径1.5 mm的取1／9菌量上机；菌落直径2 mm的取1／27菌量上机；菌落直径2.5 mm的取1／81菌量上机。当观察LC-MS／MS技术的线性情况时，还需要取1／243、1／729、1／2 187的菌量进行上机分析。

不同稀释度的样品制备过程如下：取胰酶消化后的原始样品33 μL，加入100 μL 1%甲酸，此时样品的菌量为原始样品的1／9；取此1／9 稀释度的样品30 μL，加入60 μL 1%甲酸，此时样品菌量为原始样品的1／27；取此1／27稀释度的样品30 μL，加入60 μL 1%甲酸，此时样品菌量为原始样品的1／81；重复此稀释方法直至菌量为原始样品的1／2 187。

1.4 LC-MS／MS检测 根据菌落大小以及检测目的不同，取上述不同稀释度的样品10 μL 加载至0.3 mm×5 mm C18 预柱6 min，后预柱自动切换为自填充的C18纳米LC 柱进行乙腈梯度洗脱，乙腈梯度为5% ～36%，分离速度为300 nL／min，洗脱45 min，然后用95%乙腈冲洗5 min，用缓冲液A（5%乙腈，0.1%甲酸）平衡10 min。以高通量模式进行多样品连续分析时，为消除样本在系统内残留造成的样本之间的携带污染，先运行2次空白样品的梯度检测：第1 次用“锯齿状”梯度，即通过连续多次由低到高的乙腈浓度切换循环，达到充分清洗色谱柱的目的；第2次用样本检测时使用的梯度冲洗和平衡色谱系统。2 次空白样品检测完成后再进行样本检测。

1.5 通用细菌鉴定数据库的建立及检索 参照Tracz等［14］方法。即利用来源于NCBI参考数据库（ftp：／ ／ftp.ncbi.nih.gov／genomes／Bacteria／all.faa.tar.gz）的2 026株具有完整细菌基因组所对应的蛋白质序列建立基因组氨基酸序列数据库，该数据库中每一条数据包含基因组名称+源于基因组的所有蛋白质序列的串联（在2个蛋白质序列之间插有1个字母J），这样生成的一个假蛋白多聚体代表该基因组所代表的细菌种类。

使用LTQ-Orbitrap XL系统以数据依赖模式采集质谱数据，进行肽离子扫描及片段化分析。将质谱数据使用Mascot 2.3搜索引擎（Matrix Science公司）搜索自行建立的通用细菌数据库。搜索参数设定为：质量允许误差30 ppm，胰蛋白酶酶切，允许2个漏切位点；固定修饰：无；可变修饰：甲硫氨酸氧化。得分最高的即为该测试菌株的鉴定结果。

1.6 MALDI-TOF MS 鉴定 按照Bruker MALDI Biotyper TOF系统标准操作规程进行相关实验菌株的鉴定，Biotyper数据库版本为第9版（DB_8468）。

1.7 统计学分析 用SPSS 12.0 软件进行。观察LC-MS／MS技术的检测线性，以log10（样品稀释倍数，sample loading ratio）作为横坐标，以log10（肽段数量，peptide number）为纵坐标，使用线性回归的方法观察稀释倍数和对应的肽段数量之间的关系。

2 结果

2.1 LC-MS／MS鉴定准确率 单个克隆的41株标准菌株与68株临床菌株LC-MS／MS鉴定率见表1。无论标准菌株还是临床菌株，LC-MS／MS 鉴定的准确率均达到100%。

表1 LC-MS／MS技术对单个克隆的标准及临床菌株的鉴定准确率

2.2 LC-MS／MS检测分析样品稀释倍数和对应的肽段数量之间的线性观察 使用大肠埃希菌、志贺菌、奈瑟菌及葡萄球菌共13株菌株（871215、EC214、090414、1105、1106、1107、1100、ATCC13090、87004、35562、ATCC13102、NCTC11858、ATCC14458）评 估LC-MS／MS技术的检测线性。对13株标准菌株的稀释倍数和相应的肽段数量进行线性分析发现，稀释倍数和相应的肽段数量之间存在高度的相关性，相关系数分别为0.991 9、0.962 1、0.985 2、0.984 3、0.925 1、0.978 7、0.930 0、0.985 6、0.977 5、0.967 5、0.958 4、0.941 5和0.956 2。

2.3 LC-MS／MS 和MALDI-TOF MS 鉴定结果的比较 共选择9株奈瑟菌属菌株、3株大肠埃希菌、10株志贺菌属菌株、3株沙门菌属菌株、1株斯氏弓形菌、2株葡萄球菌和3株李斯特菌共31株菌株进行LC-MS／MS和MALDI-TOF MS 两种鉴定方法的比较。结果显示，使用MALDI-TOF MS 技术时，2 株多糖奈瑟菌被错误地鉴定为脑膜炎奈瑟菌，1 株大肠埃希菌被错误地鉴定为痢疾志贺菌（4 次鉴定中有2次为痢疾志贺菌），10 株痢疾志贺菌均被错误地鉴定为大肠埃希菌，1 株肠沙门菌肠炎亚种汤普逊血清型被鉴定为鼠伤寒，肠伤寒肠炎亚种肠炎血清型只被鉴定到属的水平，尚有6次鉴定并没有给出质谱峰以及可信的鉴定血清型；而LC-MS／MS技术则对上述所有菌株均给出准确的鉴定。

3 讨论

LC-MS／MS 技术使用胰蛋白酶将病原菌酶切成肽段混合物，液相色谱（LC）将肽段混合物进行分离后进入串联质谱仪（MS／MS），分别生成一级谱图和二级谱图，通过算法的拼接以及相应数据库的搜索比对，获得精准的氨基酸序列信息，实现对病原菌的精准鉴定和分型。已有学者将基于LC-MS／MS的鸟枪法蛋白质组学的方法和原理应用到微生物的鉴定领域［14］、细菌分型及毒素鉴定领域［7-13，15］。基于对LC-MS／MS技术的深刻理解以及在CLSI 和ICH 关于LC-MS／MS 技术的指南指导下［16］，Cheng等从2013 就开始该技术在鉴定大肠埃希菌、沙门菌的鞭毛抗原以及志贺毒素方面的研究［8-13］。

本研究对MALDI-TOF MS 无法精准识别的大肠埃希菌与志贺菌以及奈瑟菌属的某些种进行了LC-MS／MS 检测分析，并评估了该分析技术的线性。结果显示，无论是标准菌株还是临床菌株，本研究建立的LC-MS／MS 检测分析方法的鉴定准确率均达到100%；样品的稀释倍数和检测获得肽段数量之间具有高度相关性，初步说明串联质谱技术在病原菌鉴定方面有其特定的优势。原始样品中被胰酶随机切开的肽段数量很多，随着原始样品被逐渐稀释，肽段数量会逐渐减少，然而由于LC-MS／MS技术的灵敏和特异，随机被切开的含量很少的氨基酸序列依然能够被检出，这些特异的氨基酸序列通过搜索对应的数据库依然能将细菌正确地鉴定到种的水平。这种倍比稀释所获得的肽段数量和稀释倍数之间还存在着良好的线性关系，表明LC-MS／MS技术不但灵敏，还非常稳定，因为每次从样品中捕获的肽段数量随着样品逐渐被稀释，而在等比例降低。未来需要扩大菌株数量来进行更广泛和深入的验证。

综上所述，本研究结果表明，LC-MS／MS技术结合自行建立的数据库能够在氨基酸序列水平对病原菌进行精准鉴定，即便2种细菌的基因相似度为99%，且该技术既稳定又灵敏。本研究结果为未来用该技术建立高灵敏度、高特异性、高准确度、高通量和快速的病原菌鉴定、分型检测新方法奠定基础。

至谢 本课题得到加拿大国家微生物实验室GRDI 基金PRJ-0049的项目支持。