基于EuNPs的荧光侧流免疫层析联合双重RPA检测HPV16和HPV18的价值

王文文 马骉 厉佳丽 许健

人类乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染被认为是宫颈癌的主要病因之一。全世界70%的宫颈癌病例与高危型HPV16和HPV18的持续感染相关［1］。我国每年宫颈癌患病人数10.97万，尤其在15~44岁年龄段女性中，癌症感染风险高居第3位［2］。宫颈癌筛查已从单独的细胞形态学观察，发展到现在的HPV病毒核酸检测［3］。目前HPV16和HPV18的分子水平检测技术主要是荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）和环介导等温扩增技术LAMP（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），前者依赖昂贵仪器不适合现场检测，后者受限于多重能力不适合多目标同步检测［4］。HPV基因组中的L1保守区广泛用于病毒的鉴定［5］。检测宫颈上皮细胞样本中病毒的高保守、高特异性片段，有助于判断高危型HPV16和HPV18的感染程度。本研究将重组酶聚合酶扩增（RPA）技术［6］与侧向流免疫层析技术（LFIC）联合［7］，使用铕纳米粒子（EuNPs）取代胶体金作为标记物［8］，实现HPV16和HPV18病毒核酸同时检测，提供一种快速、简便、敏感、高效的临床早期筛查方法。

1 材料与方法

1.1 样本采集与核酸提取 选取2019年8月至2020年1月浙江中医药大学附属第一医院采集的女性宫颈分泌物样本248例。样本经过PCR-反向点杂交法［人乳头瘤病毒基因分型（23型）检测试剂盒］筛查后确定HPV病毒感染分型。选取单一感染（n=123），混合感染（n=60）和阴性（n=65）样本，其中HPV16阳性样本29例，HPV18阳性样本26例，保存在-80 ℃。采用裂解法快速提取病毒基因组DNA：取200 μL样本液，与裂解液［800 mM盐酸胍，50 mM Tris-HCl（pH 8.0），0.5% Triton-X100，1% Tween-20，40 μg/mL 蛋白酶K］混匀后，95 ℃孵育10 min。6,000 r/min离心，1 min后，上清液保存在-20℃，用于核酸扩增。

1.2 主要试剂与仪器 羧基修饰的EuNPs［购自和卓生物科技（上海）有限公司）］；牛血清白蛋白（BSA）、Triton-X100（购自美国Sigma-Aldrich公司）；羊抗鼠二抗、Hi-Flow Plus 180硝酸纤维素膜（300×25 mm）、Ahlstrom玻璃纤维膜（用作样品垫和结合垫）、H21吸水纸（用作吸水垫）与PVC底板（购自浙江迪恩生物科技股份有限公司）；nfo RPA恒温扩增试剂盒（购自英国TwistDX公司）；Tween-20（购自阿拉丁试剂（上海）有限公司）；其他化学试剂均为分析纯（购自上海国药集团化学试剂有限公司）。Mini-6KS便携式低速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）用于HPV病毒基因组的快速提取；T2DDA台式点膜喷金一体机、C6切条机（杭州韩感科技有限公司）用于制备荧光免疫层析试纸条；365 nm便携式紫外灯（北京海天有诚科技有限公司）用于观察荧光试纸条视觉检测结果分析；FICS2011-B14荧光读数仪（苏州海尔曼精密仪器有限公司）用于EuNPs荧光试纸条的扫描分析；F-4500荧光光谱仪（日本东京Hitachi公司）用于EuNPs纳米颗粒及其标记单克隆抗体探针的表征分析。

1.3 引物和探针设计 针对HPV16和HPV18基因保守区域（L1），使用Primer 5软件自行设计特异性引物和探针。选取序列的GenBank登录号分别为HPV16（FJ797058.1）和HPV18（MH057744.1）。采用地高辛（Digoxin）标记下游引物，生物素（Biotin）和羧基荧光素（FAM）分别标记nfo探针。引物和探针见表1。

表1 HPV16和HPV18特异性RPA引物探针序列

1.4 荧光免疫层析试纸条的制备 用800 μL MES缓冲液（0.05 mol/L，pH 8.2）溶解2 mg羧基修饰的EuNPs。加入30 μL的EDC孵育30 min后，离心（12,000 r/min，25 min）去除多余活化剂。加入10 μg抗地高辛单克隆抗体（anti-digoxin mAb）搅拌偶联（25℃，2 h），离心（12,000 r/mim，2 min）去除多余抗体。重悬沉淀后的EuNPs-mAb保存在4℃备用。免疫层析试纸条由样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜，吸水纸和PVC底板组成。NC膜上的两条测试线和控制线间隔3 mm，分别固定1.2 mg/mL抗FAM抗体（anti-FAM antibody，T1线）、0.8 mg/mL抗生物素抗体（anti-biotin antibody，T2线）和1.5 mg/mL羊抗鼠二抗（IgG，C线）。EuNPs-mAb稀释20倍，以1 μL/cm的喷涂量均匀分布在结合垫上。NC膜和结合垫置于37℃恒温干燥箱2 h。试纸条组装后室温干燥，密封保存备用。

1.5 双重EuNPs-LFIC-RPA检测 RPA反应体系体积为50 μL，包含2x反应缓冲液、10 μmol/L引物、2.5 μmol/L探针、14 μmol/L醋酸镁、反应酶和模板DNA。反应液37℃孵育10 min，用Tris buffer（pH 8.0）稀释50倍后滴入荧光免疫层析试纸条。静置5 min后，在365 nm紫外灯下观察结果。随后利用FIC-S2011-B14荧光读数仪扫描EuNPs荧光试纸条，进行定量分析。

1.6 参数优化 为达到最优的检测效果，对引物探针浓度比例、核酸扩增时间、抗体标记量、试纸条包被浓度、免疫孵育时间、EuNPs-mAb偶联物与单克隆抗体浓度等进行优化。引物探针浓度比例分别设置为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8；核酸扩增时间分别设置为5、10、15、20 min；抗体标记浓度分别设置为2.5、5、10、20、40 μg/mL；T线包被抗体浓度依次为：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，C线包被抗体浓度依次为：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL；试纸条孵育时间分别设置为1、5、10、20 min；T线抗体包被抗体浓度依次为：0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，EuNPs-mAb偶联物浓度依次为：2、4、6、8、10 ng/mL。每个参数条件测试3次记录数据进行分析。

1.7 样品分析 通过10倍浓度梯度稀释提取的HPV16和HPV18病毒DNA进行敏感度实验。以浓度对数值为X轴，以相对荧光强度（T/C值）为Y轴绘制标准曲线。应用其他亚型样本提取DNA进行特异性测试，观察是否出现交叉反应。采用EuNPs-LFIC-RPA方法检测样本，结果与PCR-反向点杂交法对比。

1.8 统计学方法 计数资料以n（%）表示，采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光免疫层析试纸条结果判读 RPA上游引物与标记了地高辛的下游引物配对，同时加入与下游引物重叠区同源且标记荧光素的nfo探针进行反应。利用nfo酶识别探针中四氢呋喃（THF）位置的特点，通过Bsu聚合酶延伸，生成FAM或Biotin标记的双链DNA扩增产物。RPA扩增产物一端被EuNPs-mAb捕获，另一端被标记对应基团的特异性抗体捕获并固定在T线处。固定在C线上的pAb作为分析对照，捕获EuNPs-mAb。在365 nm激发光下获得荧光信号，借助读数仪获取T线与C线的荧光信号强度比。若T1线或T2线检测出荧光值，分别表明HPV16和HPV18为阳性；若C线无荧光值，证明试纸条失效。

2.2 参数优化 通过优化实验确定，引物探针浓度比例为1∶1时，HPV16和HPV18扩增效果最好。RPA反应进行到10 min后，相对荧光强度（T/C值）趋于平稳。制备荧光探针（EuNPs-mAb）的抗体标记量为5 μg/mL时，获得最高的测试荧光值。T线包被抗体浓度为0.8 mg/mL，C线包被抗体浓度为1.5 mg/mL，EuNPs-mAb偶联物浓度为8 ng/mL时，T/C值最高。试纸条孵育5 min即可达到理想的读数状态。

2.3 敏感度和特异性评估 敏感度实验结果显示，EuNPs-LFIC-RPA可以检测到100 ng/μL水平的HPV病毒。应用最小二乘法拟合，以相应病毒浓度对数值为横坐标，相对荧光强度（T/C值）为纵坐标，得到线性回归方程分别为HPV16：y=0.2653x-0.0108，R2=0.9926；HPV18：y=0.2852x-0.177，R2=0.9911。相关系数表明在106~100 ng/μL范围内线性较好。特异性实验结果中，HPV其他亚型扩增后，并未测得荧光值，只有HPV16和HPV18扩增产物扫描得到较高的荧光值。

2.4 实际样本检测分析 采用EuNPs-LFIC-RPA方法对经过PCR-反向点杂交法鉴定的248例临床样本检测，HPV16、HPV18和HPV16/18的阳性检出率分别为12.50%、11.29%和19.35%，均略高于试剂盒检测结果（见表2）。EuNPs-LFIC-RPA方法检测HPV16的阳性预测值和阴性预测值分别为90.32%和99.54%；检测HPV18的阳性预测值和阴性预测值分别为85.71%和99.09%；同时检测HPV16和HPV18的阳性预测值和阴性预测值分别为100%和98.50%。

表2 EuNPs-LFIC-RPA方法和PCR-反向点杂交法检测临床样本的结果比较

3 讨论

HPV是DNA病毒，其主要结构蛋白为HPVLl蛋白，HPVLl蛋白和L2蛋白构成HPV衣壳蛋白，HPV衣壳蛋白包裹HPV形成新的病毒颗粒，高危型HPVLl蛋白为变异体，和L2蛋白不能组装成HPV病毒颗粒，从而使DNA病毒在宿主细胞内大量复制并整合到宿主细胞DNA中，引起感染HPV的细胞无限增殖，导致细胞发生恶性转化［9］。HPV有多种亚型，引起宫颈病变的有30多种亚型，HPV16和HPV18是最常见的高危型HPV感染亚型，高危型HPV感染后更易导致感染细胞发生永生化，使病毒清除时间延长，从而引起HPV感染，不仅引起外生殖器疣，还可引起宫颈上皮内瘤变、宫颈癌等［10］，而早期宫颈癌患者的预后相对较好。因此，针对性开展HPV基因检测及基因分型筛查，能及时发现宫颈癌高危人群，且可对HPV阳性群体风险进行分级评价，有利于对病情准确评估，也可减少对患者过度的有创诊断。

早期宫颈细胞学检查是做好癌前病变筛查的主要方法，有助于降低宫颈癌罹患风险并及早预防治疗［11］。针对高危型HPV病毒的分子水平检测技术，除了作为细胞学检查的辅助方法，越来越多地应用到临床检测领域［12-13］。本研究建立的EuNPs-LFIC-RPA检测方法，采用RPA技术在37℃等温条件下具有快速扩增未经纯化微量核酸样品的独特优势，加上免疫层析技术非常适合现场诊断的特点，通过检测荧光信号强度定量分析病毒载量，实现对宫颈细胞样本内高危亚型HPV16和HPV18病毒的联合快速筛查。核酸扩增过程中可能会出现干扰结果，假阴性结果可能误导诊断且丧失最佳治疗时机，假阳性结果可能带来频繁复查和心理负担。使用荧光纳米材料EuNPs取代传统胶体金，不仅提高检测敏感度，还减少假阴性结果的出现。核酸扩增体系加入的nfo探针，不仅可以更好地与免疫层析试纸条衔接，更增加识别目标片段的特异性，降低假阳性检测风险。