骨桥蛋白及TNF-α诊断阿尔茨海默病的临床价值

刘 婷，孟新玲，李 丹，马 娜，杜 帅，张玉洁

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，占老年痴呆的50%～75%，其发病率随着世界人口的老龄化迅速攀升[1]。AD的发病机制复杂，尚无一种学说能够比较全面、合理地阐明其发病过程，除了已知的淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解而成的Aβ多肽片段假说外[2]，近几年研究证实多种免疫细胞和炎性因子可以通过各种方式参与疾病发展，并与沉积的Aβ相互作用，触发一系列神经病理反应，如Tau蛋白过磷酸化和神经原纤维缠结形成和神经元损伤，最终导致广泛的神经退行性病变和痴呆[3-4]。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种炎性因子，在各种慢性炎症和自身免疫疾病中发挥重要作用。既往的体内和体外实验表明，骨桥蛋白表达的增强很可能是应对加速的神经退行性变和病理性变化的反应[5-6]。但有关结果多局限在动物实验阶段，临床上确切的炎症致病机制尚未完全明确。因此，本研究的目的是评估骨桥蛋白水平以及各炎性细胞因子在诊断AD上的应用价值以及随访期间的变化情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料 前瞻性分析2016年11月—2019年3月新疆维吾尔自治区中医医院收治的AD以及同期非炎症性神经病(noninflammatory neurologic diseases，OND)病人120例，分为AD组和OND组，每组60例。随访1年。本研究通过医院伦理委员会审查，所有病人均由家属签署知情同意书。

1.2 诊断标准 AD的诊断参照美国神经病学、语言障碍和卒中-老年性痴呆和相关疾病学会工作组(NINCDS-ADRDA)标准中“很可能阿尔茨海默病(probable Alzheimer′s disease with mild tomoderate dementia)”的诊断标准[7]。OND组选择同期住院的非炎症性神经系统疾病的病人，如紧张型头痛、低钾性周期性麻痹。

1.3 纳入与排除标准

1.3.1 纳入标准 结合临床表现及影像学检查明确诊断为AD病人；年龄≥50岁；既往无肿瘤及精神疾病等病史者；视听功能完好，可完成记忆量表检测，无认知功能障碍者；签署知情同意书者。

1.3.2 排除标准 入院时患精神病或神经障碍；头部损伤导致的意识丧失者；酒精或药物滥用者；伴随可能影响免疫水平疾病的病人，如糖尿病、严重的肺炎、自身免疫性疾病类、风湿性关节炎、急性或慢性炎症疾病等；伴随有重大躯体疾病并危及生命者，如急性心肌梗死、严重的慢性阻塞性肺疾病；使用类固醇皮质激素及非甾体类抗炎药物者；随访资料不全或中途退出研究者；拒绝签署知情同意书者。

1.4 方法 入院后收集病人年龄、性别、体质指数(BMI)、简易精神状态检查量表(MMSE)评分等临床资料。采集病人腰椎穿刺留取的脑脊液样本、晨起空腹静脉血，-80 ℃保存，避免样本反复冻融。运用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清和脑脊液中骨桥蛋白含量，血清白细胞介素(IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-17A、转化生长因子-β1(TGF-β1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平(ELISA试剂盒购自美国R & D公司)。所有入选病人均通过门诊和住院随访1年，随访时间始于病人接受治疗的日期，止于病人死亡或随访截止日期，对失访病例按最后1次随访时间为准做删失处理。随访1年后，再次检测血清骨桥蛋白及IL-1β、IL-6、IL-17A、TGFβ-1和TNF-α水平，进行MMSE测评。对比分析随访前后各指标差异，以及评估MMSE评分、骨桥蛋白以及各细胞因子的相关性。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 随访1年后，AD组失访12例，OND组失访9例。AD组MMSE评分低于OND组，脑脊液骨桥蛋白、血清骨桥蛋白、TNF-α水平高于OND组，差异均有统计学意义(P<0.001)。详见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组随访1年后各指标比较 随访1年后，AD组MMSE评分低于OND组，血清骨桥蛋白、TNF-α水平高于OND组，差异均有统计学意义(P<0.001)。详见表2。

表2 两组随访1年后各指标比较(±s)

2.3 AD组炎性因子与疾病严重程度的相关性分析 相关性分析显示，脑脊液骨桥蛋白水平与MMSE评分呈正相关(r=0.865，P<0.001)，血清骨桥蛋白水平与MMSE评分呈正相关(r=0.853，P<0.001)，TNF-α水平与MMSE评分呈负相关(r=-0.776，P<0.001)。详见图1～图3。

图1 脑脊液骨桥蛋白水平与MMSE评分的相关性

图2 血清骨桥蛋白水平与MMSE评分的相关性

图3 血清TNF-α水平与MMSE评分的相关性

ROC分析结果显示，脑脊液骨桥蛋白、血清骨桥蛋白和TNF-α的曲线下面积(AUC)分别为0.981[95%CI(0.921，0.993)]、0.920[95%CI(0.862，0.971)]和0.910[95%CI(0.850，0.970)]，敏感度分别为90%、85%和83%，特异度分别为91%、83%和83%。脑脊液骨桥蛋白的ROC曲线下面积明显高于血清骨桥蛋白和TNF-α的曲线下面积(P<0.001)。详见表3、图4。

表3 不同标记物评估AD的ROC曲线分析

图4 脑脊液、血清骨桥蛋白及血清TNF-α诊断AD的ROC曲线

3 讨 论

AD病人的免疫炎症反应是指脑中固有免疫细胞如小胶质细胞、星形胶质细胞等表达和释放大量神经炎症介质，包括补体激动剂和抑制剂、趋化因子、细胞因子、氧自由基和炎症酶系统，这些炎症介质通过各种方式促进淀粉样蛋白前体蛋白加工进而损伤神经末梢活性引发突触功能障碍，促进神经元损伤，该过程一旦启动，将对AD进程产生持续影响[8-9]。因此，本研究拟评估骨桥蛋白和炎症相关因子与AD病情进展之间的相关性分析。从而在免疫炎症角度上揭示该疾病的发病机制及病情发展规律，进而为AD的治疗提供新的思路和相应的理论基础。

本研究结果横向研究显示，AD组较OND组无论在入院时还是随访1年，均具有较高的血清TNF-α和骨桥蛋白水平，这与既往研究相似，研究认为人脑中所含有小胶质细胞和星形胶质细胞可以被感染，炎症性疾病，局部缺血和创伤性损伤等中枢神经系统的各种病理过程激活而分泌大量TNF-α等炎性因子[10]，并且对AD病人死亡后的大脑分析发现，TNF-α可以定位在淀粉样斑块中[11]。本研究显示，入院时AD组的脑脊液中骨桥蛋白水平较OND组明显升高，这可能与刚诊断为AD时，炎症反应主要发生于内嗅、颞顶叶和扣带回皮质等脑脆弱区，引起急性期蛋白和促炎介质的表达增加有关。而脑脊液内的炎性因子可以直接接触大脑，能准确反映中枢神经系统正在进行的炎症过程，因此，脑脊液骨桥蛋白水平的反应时间早于血清骨桥蛋白水平[12]。同时横向研究还显示，随访前后两组之间其余的炎性因子水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。何璐等[13]进行的70 种免疫及炎症相关蛋白研究也证实，AD组和健康对照组之间除TNF-α外，其余常见的如IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17A等炎性因子比较差异均无统计学意义(P>0.05)。但也有研究和荟萃分析显示，AD病人外周血中IL-6、IL-8、IL-10等浓度明显高于健康对照组[14-16]。这可能与各研究之间存在种族差异以及检测手段和平台的差异有关，并且本研究严格排除了AD 以外其他可能影响免疫炎症水平的各种相关伴随疾病。但本研究中纵向随访研究显示，AD组随访前后MMSE评分无明显变化，并且各炎性指标之间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，这与既往研究相似。Julian等[17]进行的一项为期2年的随访研究显示，诊断AD病人的各项炎性因子比较差异均无统计学意义(P>0.05)。故不是所有的血清炎性细胞因子的改变都可以预测AD病人认知功能的下降，还需进一步大样本研究发现确切的预测标记物。

相关性分析也证实AD组脑脊液和血清骨桥蛋白水平与认知障碍严重评分呈正相关。本研究ROC曲线分析结果显示，脑脊液和血清骨桥蛋白水平、TNF-α在预测AD上具有较高的敏感度和特异度，这与既往研究相似。Comi等[18]研究表明，MMSE评分>23分的AD病人脑脊液骨桥蛋白含量明显高于MMSE评分≤23分的病人，这可能与认知功能下降有关。尽管骨桥蛋白是AD病人认知功能减退的关键促炎细胞因子，但其确切作用及其潜在机制尚不清楚。Th17细胞已被证明是各种炎症和自身免疫疾病的致病效应细胞。动物研究显示，骨桥蛋白通过抑制小鼠树突状细胞中IL-17A的分泌，在Th17细胞的分化过程中发挥关键作用[19]。也有研究显示，AD病人Th17 细胞增加，骨桥蛋白水平升高可能通过增强活化T细胞的存活而加剧AD病人脑中出现的异常免疫反应[20]。此外还有研究发现，骨桥蛋白在AD病人海马CA1区锥体细胞中的表达增强，骨桥蛋白染色强度与淀粉样β蛋白负荷和年龄呈正相关[21]。动物实验研究发现，Aβ诱导的AD模型鼠血清和脑脊液骨桥蛋白同时升高，且与病程相关；外源给予骨桥蛋白能够改善Aβ诱发的小胶质细胞反应[22]。这些研究均表明骨桥蛋白在神经退行性疾病的发展过程中可能有两种相反的作用。一方面，骨桥蛋白通过上调髓鞘形成和再髓鞘形成发挥神经保护剂的作用；另一方面，骨桥蛋白通过引起神经元毒性和死亡而具有疾病加速作用[23-24]。

结合本研究和既往研究推测，TNF-α和骨桥蛋白可能是一种新的潜在的AD生物学标志物，并在AD的病理生理机制中发挥重要作用。但本研究为单中心研究，在排除标准上限制了大量会影响免疫功能的因素，以及部分病人在随访资料不全，导致AD的发病率有可能被低估；其次，本研究仅评估了少量炎性细胞因子的变化情况，由于检测指标和平台的差异，仍需进一步扩大检测指标进行综合分析；本研究随访1年后未能收集脑脊液中骨桥蛋白变化情况，因此仍需进一步研究证实该结论。

综上所述，TNF-α和骨桥蛋白与AD病情的严重程度密切相关，在诊断AD上均具有更高的敏感性和特异性，可以作为AD的潜在生物标志物组合。但对于其他炎性因子与AD病情严重程度的关系仍有待于进一步研究。