柴胡加龙骨牡蛎汤对心肌梗死合并焦虑大鼠HPA轴的影响

陈雅丽，侯季秋，王 威，靳会会，安 莹，贾静芸，赵海滨

近年来，冠心病和心理疾病已成为全球发病率和致死率的主要原因[1-2]，且两者关系密切。研究表明，心理疾病或心理情绪在冠心病病人中尤为常见，并可能与心血管疾病的发病率和死亡率大幅增加有关[2]，而患有精神疾病的病人亦有较高的患冠心病风险[3]。焦虑是心理疾病中最常见的一种心理情绪，严重影响人们的身心健康，也有研究证实了焦虑与冠心病病人的死亡风险增加有关[2，4-5]。由于冠心病合并焦虑发生的病理机制尚未明确，西医临床缺乏有效治疗措施。有针对治疗冠心病合并焦虑病人的研究表明，只有33.3%的焦虑症状能通过干预措施(包括药物、心理咨询、教育及替代性疗法等)得到缓解[6]。

柴胡加龙骨牡蛎汤出自《伤寒论》，是古今惯用的经典名方。已有研究表明，柴胡加龙骨牡蛎汤能缓解心肌梗死合并焦虑障碍病人的心绞痛症状和焦虑状态，总有效率达93%[7]。且研究显示，柴胡加龙骨牡蛎汤可通过动员骨髓干细胞循环、减轻炎症反应等方面改善心肌缺血并调节海马区神经递质的平衡[8-9]。本研究基于下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴从神经、体液、免疫方面探讨柴胡加龙骨牡蛎汤治疗心肌梗死合并焦虑的可能病理机制，为柴胡加龙骨牡蛎汤多靶点、多途径治疗心肌梗死合并焦虑提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级6周龄健康雄性SD大鼠36只，体质量170～190 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证编号：SCXK(京)2012-0001。动物饲养于北京中医药大学SPF级动物房，喂常规大鼠饲料及饮用水，本实验获得北京中医药大学伦理委员会批准(伦理审查编号：BUCM-4-2019040102-2103)。

1.2 实验药物 柴胡加龙骨牡蛎汤组方：柴胡12 g，黄芩9 g，龙骨15 g，牡蛎15 g，生姜9 g，党参9 g，桂枝9 g，茯苓15 g，半夏9 g，大黄9 g，珍珠母(代铅丹)15 g，大枣10 g。实验使用中药颗粒剂、配方颗粒均购自北京康仁堂药业有限公司。

1.3 主要试剂与仪器 大鼠促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)酶联免疫试剂盒(目录号：E02C0029，BlueGene)、大鼠促肾上腺皮质激素(ACTH)酶联免疫试剂盒(目录号：E02A0005，BlueGene)、大鼠皮质酮(CORT)酶联免疫试剂盒(目录号：E02C0006，BlueGene)。小动物呼吸机(上海奥尔科特生物技术有限公司)，小动物超声影像系统(加拿大Visual Sonics公司)，标准规格酶标仪(Thermo Scientific公司，型号：Multiskan MK3)，自动洗板机(北京拓普分析仪器有限公司，型号：DEM-3)，离心机(美国Sigma，型号：3K18)。

1.4 实验方法

1.4.1 建模 本研究依据前期造模研究基础[10]，采用不确定空瓶刺激法结合冠状动脉左前降支结扎建立心肌梗死合并焦虑模型，即复合模型。

1.4.1.1 广泛性焦虑模型 参照文献及前期研究[10-11]，采用不确定空瓶刺激法。建模周期21 d，建模期间大鼠自由摄食。第1天～第7天进行定时喂水训练，每日08：00～08：10和20：00～20：10给予饮水，其他时间段禁水，让大鼠处于口渴状态。第8天～第21天进行空瓶应激，每日早晚随机选取一个饮水时间段给予空瓶，诱发其情绪应激，另一时间段给予喂水。

1.4.1.2 心肌梗死模型 采用左冠状动脉前降支结扎构建心肌梗死动物模型。术前，准备小动物呼吸机，调整潮气量为每次0.8 mL，吸呼比为1∶2，通气频率为80次/min。将动物称重后用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，备皮，消毒，固定大鼠，气管插管，连接小动物呼吸机。在大鼠胸骨旁左侧第3肋～第4肋间定位，沿肋间方向切开皮肤，长约1.5 cm，逐层分离皮下组织、肌肉，打开心包膜。用5.0缝合线，于心耳边缘下2 mm处结扎左冠状动脉前降支，进针深度控制在1 mm、宽度1～2 mm，收线打结。术中肉眼可见结扎线远端左室前外侧壁心肌变白区，逐层关闭胸腔。后移除呼吸机，轻捏大鼠胸廓，辅助其恢复呼吸。术后腹腔注射0.2 mL利多卡因防止心律失常，4×105U青霉素预防术后感染。术中及术后大鼠苏醒前注意保暖。术后第2天行心电图检查，导联Ⅰ、aVL、V1～V6中有6个及以上导联出现病理性Q波即为心肌梗死模型成功。假手术组穿线后打松结，余步骤相同。

1.4.1.3 复合模型 即心肌梗死合并焦虑模型[10]，在不确定空瓶刺激建模的第15天对大鼠实行心肌梗死手术，至第22天造模完成。

1.4.2 分组及给药

1.4.2.1 分组 心肌梗死术后第2天根据心电图Ⅰ、aVL、V1～V6导联中的病理性Q波进行区组随机分组。本实验共设计4组，将心肌梗死成模大鼠分为心肌梗死组(10只)、复合模型组(心肌梗死模型合并焦虑模型，10只)、中药组(复合模型+龙骨牡蛎汤灌胃，10只)、假手术组(6只)。

1.4.2.2 给药 根据前期实验中药剂量筛选[3]，中药组大鼠给药量按成人(体重60 kg)的6倍剂量折算，折合大鼠日生药剂量为13.6 g/kg，每剂中药颗粒用蒸馏水配液为100 mL，中药组于术后第2天给予柴胡加龙骨牡蛎颗粒剂(10 mL/kg)灌胃，每日1次；假手术组、心肌梗死组及复合模型组均于术后第2天予蒸馏水(10 mL/kg)灌胃，每日1次。至建模第22天。对大鼠进行超声心动图检查及行为学实验后处死动物，取血、心脏及海马。

1.4.3 超声心动图检测 将大鼠称重后用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定，左前胸大面积备皮，取左心室短轴切面，探测M型曲线，每只大鼠检测3个连续心动周期，取平均值。主要检测大鼠的左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室短轴缩短率(LVFS)、左室射血分数(LVEF)。

1.4.4 旷场实验(OFT) 本实验采用体积为100 cm×100 cm×40 cm的木制黑箱，底板画有25个正方形格子，在安静、弱光的环境下进行。先让大鼠适应性活动5 min，再将大鼠放在箱底中央格，开始计时并摄像，观察6 min内大鼠的活动情况。记录大鼠在敞箱内水平运动得分(水平运动格子数)及垂直运动得分(垂直运动次数)。

1.4.5 高架十字迷宫实验(EPM) 该实验装置由两条相对开臂(50 cm×10 cm)和相对闭臂(50 cm×10 cm×40 cm)组成，中央有一开阔区(10 cm×10 cm)，十字迷宫离地面50 cm。先让大鼠自由活动5 min，再将大鼠面向开放臂放入，开始计时并录像，观察5 min内大鼠在开臂和闭臂的活动情况，记录大鼠进入开臂次数(OE)和停留时间(OT)，进入闭臂次数(CE)和停留时间(CT)，计算OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)的比值，OE/(OE+CE)与OT/(OT+CT)的比值越大说明大鼠越倾向于待在开臂里。

1.4.6 Masson染色及尼氏染色 大鼠麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，用灌流针自左心室插入，先后用生理盐水和4%多聚甲醛灌流固定，摘取心脏和大脑浸泡于组织固定液中，静置48 h后制备切片，观察心脏Masson染色和大脑尼氏染色。

1.4.7 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血CRF、ACTH及CORT含量 大鼠麻醉后，打开腹腔，拨开内脏暴露腹主动脉，用采血针进行腹主动脉采血并置于普通采血管中，室温静置2 h，3 000 r/min离心15 min，取上清液进行检测，根据ELISA试剂盒说明书进行指标检测。

1.5 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。将多组独立样本进行正态性检验和方差齐性检验，如方差齐则采用单因素方差分析，必要时采用LSD，方差不齐则采用独立样本秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组大鼠超声心动图指标比较 与假手术组比较，心肌梗死组与复合模型组LVEF及LVFS明显下降，LVESD和LVEDD明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与复合模型组比较，中药组LVEF及LVFS升高，LVESD和LVEDD明显下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见图1。

与假手术组比较，＊ P<0.01；与复合模型组比较，# P<0.01。

2.2 4组大鼠行为学指标比较 旷场实验结果显示，与假手术组比较，复合模型组大鼠的水平运动得分和垂直运动得分均明显减少，活动能力下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与复合模型组比较，中药组大鼠水平运动得分增加，差异有统计学意义(P<0.05)。高架十字迷宫实验结果显示，与假手术组比较，心肌梗死组和复合模型组大鼠OE/(OE+CE)明显下降，复合模型组OT/(OT+CT)明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与心肌梗死组比较，复合模型组大鼠OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，说明复合模型组大鼠更倾向于待在闭臂里；与复合模型组比较，中药组大鼠OE/(OE+CE)和OT/(OT+CT)明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，说明中药组大鼠更倾向于待在开臂里 。详见图2。

与假手术组比较，＊ P<0.01；与心肌梗死组比较，# P<0.05；与复合模型组比较，△ P<0.05。

2.3 4组大鼠病理染色结果比较 心肌Masson染色结果显示：假手术组心肌细胞结构正常，肌纤维排列整齐，染色均匀；心肌梗死组和复合模型组心肌细胞坏死，局部被结缔组织取代修复，可见大量成纤维细胞，心肌纤维化严重；中药组心肌细胞坏死，局部被结缔组织取代修复，可见成纤维细胞，心肌纤维化，但其纤维化程度明显少于复合模型组。海马尼氏染色结果显示：假手术组细胞排列紧密；心肌梗死、复合模型组和中药组细胞排列相对松散，尼氏小体数量减少；与假手术组比较，复合模型组尼氏小体数量明显减少，与复合模型组比较，中药组尼氏小体相对增多。详见图3。

图3 4组大鼠心肌Masson染色和海马尼氏染色结果(×400倍)

2.4 4组大鼠外周血CRF、ACTH及CORT含量比较 与假手术组比较，心肌梗死组及复合模型组外周血CRF、ACTH及CORT含量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与心肌梗死组比较，复合模型组外周血ACTH及CORT含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与复合模型组比较，中药组外周血CRF、ACTH及CORT含量明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图4。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与心肌梗死组比较， # P<0.01；与复合模型组比较，△ P<0.05。

3 讨 论

HPA轴是神经内分泌系统的重要组成部分，在人体适应环境时发挥关键的调控作用。正常情况下，HPA轴在一定范围内进行直接调节和反馈互动，以维持人体神经-体液的动态变化。应激、创伤、压力相关性心理疾病[12-13]、心血管疾病[14]等病理性应激均能出现HPA轴功能紊乱。长期的HPA轴失调又会导致各种应激相关性症状及疾病。

冠心病发病率较高，也是全球人群死亡的主要病因[15]。焦虑、抑郁与冠状动脉慢血流密切相关[16]，慢性持续性的精神压力与冠心病的发生发展有关[17]，其内在机制可能是通过神经内分泌的调节来实现[18]。研究表明，冠心病病人持续的焦虑和抑郁症状是导致心血管不良事件发生的原因之一，对冠心病预后产生不良影响[19]。冠心病的发生发展与心理精神压力关系密切，近年关于焦虑、抑郁障碍的研究，希望能从改善HPA轴功能方面治疗焦虑、抑郁，但缺乏有效的基础研究[20]。

本研究通过对模型的制备及临床有效方剂柴胡加龙骨牡蛎汤对心肌梗死合并焦虑大鼠模型进行干预，观察心肌梗死大鼠HPA轴的情况及柴胡加龙骨牡蛎汤对心肌梗死合并焦虑大鼠HPA轴的影响。结果显示，与假手术组比较，心肌梗死大鼠HPA轴功能相对亢进；与复合模型组比较，柴胡加龙骨牡蛎汤能改善心肌梗死合并焦虑大鼠心功能，增加心肌梗死合并焦虑大鼠运动能力，减少坏死心肌细胞炎性浸润；增加海马区尼氏小体数量；能有效调控HPA轴功能，使之趋向于正常功能状态。

综上所述，冠心病合并焦虑与HPA轴功能失调关系密切，可能为二者共病的中间影响因素。本研究显示了柴胡加龙骨牡蛎汤的有效性及其机制可能与调控HPA轴有关，为中药方剂治疗冠心病合并焦虑提供了一定的理论依据。但由于影响和调控HPA轴的因素众多，尚不知柴胡加龙骨牡蛎汤是直接调控还是通过其他物质间接调控HPA轴功能，仍需进一步研究。