仿生型低温保护剂研究进展

陈曦 ，李维杰 ，刘宝林*

(1-上海理工大学生物系统热科学研究所，上海 200093；2-上海市肿瘤能量治疗技术与器械协同创新中心，上海 200093；3-上海市生物资源低温保存技术服务平台，上海 200093)

0 引言

在生物和医学中，“低温”是指低于正常体温（37 ℃）直至低于4 K的温度范围[1]。低温生物学是一门研究低温条件下（0 ℃以下或接近0 ℃）生命现象以及生物体低温保存的科学[2]。低温保存技术是指将活的生物体采用特殊的方法冷却至低温（一般为-80 ℃或-196 ℃），并长期保存；待需要时，将生物体按特殊的方法加热至正常温度，仍可获得活的生物体[3]。

在此项技术之中，低温保护剂是必不可少的一个环节。1949年，英国生物学家POLGE等[4]偶然发现在低温条件下，利用慢速冷冻甘油对精子具有保护特性，引起极大的反响，“低温保存”一词由此诞生。紧接着1959年，由于二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）比甘油渗透细胞速度更快，成为具有普适性的保护剂[5]。低温保存技术已经逐渐发展为细胞疗法、组织工程、血液保存、辅助生殖和疫苗储藏、生物样本库等生物医学方面的基础和保障[6]。随着材料和化学的发展与进步，天然无毒的低温保护剂研发成为当今的研究热点。

本文从低温冷冻保存机制、低温保护剂种类作用、新型保护剂以及应用几方面来综合讲述低温保护剂的研究现状。

1 低温保存冷冻损伤机制

细胞处于深低温（-80 ℃或-196 ℃）时，绝大多数会失去活性甚至死亡。1972年，首次提出冻伤的“两因素假说”[7]，一种是由于慢速冷却，长时间暴露在溶液中的水转化为冰，引起细胞内外溶液的变化，细胞内的渗透压增加，细胞脱水死亡，为“溶液损伤”；另一种是由于快速冷却，细胞内形成冰晶以及缓慢升温过程的重结晶增加，为“胞内冰损伤”[8]。为了缓解低温保存对生物材料造成的损伤，添加低温保护剂尤为重要。

2 传统低温保护剂

如果细胞冻存时不加保护剂，复温后细胞结构破坏，生理和生化功能受阻，复苏存活率只有1%左右，甚至更低，因此添加低温保护剂成为冷冻保存过程中必不可少的一个环节[9-10]。主要通过缩短相变时间、降低共熔点温度和减少对细胞渗透膜的破环三个方面对细胞起到保护作用[11]。低温保护剂根据是否能够渗入细胞分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂。

2.1 渗透性保护剂

常见的渗透性保护剂有醇类（甲醇、甘油、甘露醇、山梨醇、丙二醇、乙二醇和甲酰胺等[12]）、氨基酸类（天冬氨酸、谷氨酸和l-脯氨酸）、天然两性离子分子（甜菜碱[13]和左旋肉碱[14]）和含硫有机化合物（DMSO）。此类物质相对分子质量较小，可以渗透进入细胞内部，改善细胞内过冷的情况。同时由于它的分子结构小容易与水结合，发生水合作用，形成氢键，弱化水的结晶过程，使细胞内外渗透压减少，溶液黏性增大，对“溶液损伤”起到缓解效果，起到了保护细胞的作用[15-16]。目前使用最为广泛的是DMSO和甘油，但由于其毒性较大、不易洗脱，因此对天然无毒、具有生物相容性的低温保护剂需求迫切。

2.2 非渗透性保护剂

常见的非渗透性保护剂有单糖（葡萄糖、果糖）、双糖（海藻糖、蔗糖和乳糖）、多糖（棉子糖）以及相对分子质量较大的高分子聚合物（羟乙基淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇等）[17]。此类物质具有较高的相对分子质量，不能自由进出细胞但溶于水，加入溶液之后出现过冷状态，冰晶形成受到抑制。同时可以降低细胞外液的电解质浓度，从而减少了阳离子进入细胞的数量，减少胞内冰的形成，从而起到保护细胞的作用[8]。非渗透性保护剂使用的同时经常需要搭配渗透性保护剂联合使用，避免浓度过高对细胞造成毒性损伤的同时促进细胞脱水。

3 仿生型低温保护剂

3.1 抗冻蛋白

为了适应冰点以下低温环境，生物从生理、生化与基因等层面进化出多种生存策略和机制，其中一种重要的生存策略便是合成抗冻蛋白（Antifreeze Protein，AFP）[18]。随着研究的进展，对抗冻蛋白有了更多的认识。AFP的主要作用有热滞活性、诱导结晶形态变化和抑制冰重结晶特性，从而保护细胞内蛋白和细胞膜[19]。一方面热滞活性指AFP可抑制冰晶生长，降低溶液的冻结温度，且依数效应的效果好。AFP的亲水侧链通过氢键结合到冰晶的棱柱面（优先生长面）上，允许暴露的蛋白质疏水侧链以增加的表面自由能阻止冰的进一步生长，产生双锥或针状冰晶[20]（如图1）。此外，升温过程中AFP抑制冰重结晶，使之形成细小均匀的冰晶。

图1 AFPs控制冰晶生长

3.2 天然深共晶溶剂

深共晶溶剂为两种或两种以上组分的混合物，既可以是固体也可以是液体，并且在特定成分下，室温熔点降低，原因是氢受体和氢键供体之间的络合作用产生离域电子[21]。天然深共晶溶剂（Natural Deep Eutectic Solvents，NADES）的组成物主要是代谢物，存在于极端温度环境下动物体内[22]。脯氨酸与海藻糖组合的深共晶溶剂，在-50 ℃左右仍能保持液态，相较于纯水结晶和熔融温度降低，抑制冰晶生长，可作为低温保护剂的替代品[23-24]。GERTRUDES等[23]研究发现海藻糖和甘油组合的天然深共晶溶剂对于L929细胞系具有保护作用（图2）。NADES是一种无毒绿色替代品，可以代替冷冻保存过程中传统低温保护剂。

图2 NADES低温保存工艺

3.3 纳米材料

与传统的保护剂相比，纳米材料保护剂由于其卓越的渗透性从而表现出更高的冷冻保护和有效性[25]。纳米颗粒介导是胞内递送的一种新兴的冷冻保存方法，依靠胞吞胞吐完成。刺激性响应材料因为低毒性、快速响应和容易制造等优点，在冻存过程中发挥着极大的作用[26]。冷响应聚合物（聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸丁酯共聚物）[27]、壳聚糖三聚磷酸钠纳米颗粒用来输送海藻糖[28]，提高解冻后的细胞存活率。

3.4 聚电解质

聚电解质是一类既带正电荷又带负电荷的特殊聚合物，它们可以是中性电荷，也可以是净电荷；两性离子聚合物，在正常pH条件下，净电荷通常为零。在冻存过程中需要玻璃化，使细胞适当脱水，减少冰晶尺寸，不仅重结晶抑制能力高且对细胞膜有保护作用[29]（图3）。

图3 聚电解质与细胞膜相互作用

甲基丙烯酸乙酯和甲基丙烯酸共聚物、聚羧甲基甜菜碱[30]和各种二元共聚物可作为新型保护剂。

4 仿生型低温保护剂的应用

4.1 生殖细胞的应用

低温保护剂在生殖细胞方面的应用起源于20世纪40年代首次发现甘油对保存精子具有显著效果。既甘油的发现之后，相继研究出许多小分子和大分子保护剂，脱脂奶粉在冷冻保存中对斑马鱼精子细胞质膜完整性，氧化损伤和DNA都具有一定的保护作用[31]。羧甲基纤维素因含有羧甲基基团，能增强水溶性，PAUL等[32]将其用于公羊精液的保存。TAKEUCHI等[33]发现两性高分子化合物羧化聚赖氨酸（Carboxylated Poly-l-Lysine，CPLL）作为大分子冷冻保护剂，采用0.3%CPLL+7%甘油配比对冷冻保存人类精子有显著效果。

抗冻蛋白的加入能提高鲷鱼精子存活率、运动性和直线速度[34]，由于L-脯氨酸低聚物具有与抗冻糖蛋白相同的PPII螺旋结构，QIN等[35]将L-脯氨酸低聚物低温保存卵母细胞明显提高存活率和稳定性。蛋黄是精液储存和冷冻保存补充剂的主要成分，FOROUZANFAR等[36]研究表明大豆卵磷脂可以作为蛋黄的替代品进行细胞冷冻，1%大豆卵磷脂和7%甘油作为保护剂之后，细胞存活率最高。随着近些年的研究，应用于生殖细胞和胚胎方面的低温保护剂越来越多。

4.2 体细胞的应用

我国对红细胞的低温冷冻保存研究中，甘油是目前使用最广泛的低温保护剂，但由于浓度较大、洗脱步骤繁琐，寻找天然相容性较好的保护剂尤为重要[37-38]。L-脯氨酸和改性γ-聚谷氨酸和海藻糖的天然保护剂组合[39-40]、天然两性离子分子甜菜碱、左旋肉碱抑制冰晶生长[14,41]，解冻后溶血率降低；由于天然两性离子分子的出现，BAILEY等[42]合成聚两性电解质聚（甲基乙烯醚-马来酸酐）通过保护细胞膜，解冻后存活率可达80%。基于糖肽和海藻糖的膜稳定作用合成的生物相容性糖肽，LIU等[43]将绵羊红细胞冷冻活力提高到75%，紧接着发现红景天苷的加入减轻了冷冻保存之后绵羊红细胞的氧化损伤[44]。STOLL等[45]发现脂质体、海藻糖和羟乙基淀粉对红细胞具有协同保护作用，MITCHELL等[46]首次提出高羟基化嵌段共聚物蠕虫被证明是羟乙基淀粉的合适替代品。金属有机骨架纳米粒子[47]、硫基糖苷、芳基糖苷[48-49]和聚乙烯醇[50]可以辅助红细胞的冷冻保存。

低温保护剂在其他小尺寸细胞中也有很丰富的应用，OGAWA等[51]研究发现果聚糖可以作为胎牛血清的替代冷冻保护剂，冻存小鼠杂交瘤细胞细胞存活率可达97.1%，首次发现蚕茧中的丝素蛋白冷冻人骨源性间充质干细胞，不仅调节冰晶尺寸还具有抑制重结晶的作用，存活率达到81.28%[52]。JOCHMANS等[53]发现改良过的6-羟基氯丙醇衍生物对造血干细胞、脂肪组织衍生干细胞能避免冻存中细胞死亡的情况。MATSUMURA等[54]利用具有7%质量分数的氨基和羧基混合而成的聚两性电解质ε-聚赖氨酸冻保存鼠L929细胞。RAJAN等[30]的实验室设计了其他多聚两性电解质保护剂，如DMAEMA-MAA（1:1）和右旋糖酐聚两性电解质，实现解冻后L929细胞存活率高达95%以上，且毒性低、解冻后无需去除。KURODA等[55]发现一种含有组氨酸类物质的两性离子液体对质膜有亲和力，防止出现胞内冰，作用机制与聚电解质相同。睢晓洁等[56]利用天然渗透压调节剂氯化三甲胺采用超速冷冻方法对人肺癌细胞、人宫颈癌细胞进行超低温保存。NK细胞和T细胞系在免疫治疗具有巨大潜力。ASSAL等[57]使用葡聚糖和聚赖氨酸对NK细胞慢速冻存，效果与DMSO相当；T细胞系在蔗糖、甘油和异亮氨酸的组合保护剂下胞内冰有所减少[58]。

4.3 组织切片、器官的应用

针对于组织工程、器官移植的冷冻保存也是研究热点之一，包括软骨、血管、角膜和肾脏等，冷冻方法和低温保护剂的种类越来越多。二甲基亚砜对于人小口径动脉冻存效果好于甘油、丙二醇和乙二醇[59]。MANUCHEHRABADI等[60]利用磁性氧化铁纳米颗粒，提高了生物相容性，并成功实现了大规模生物样品（80 mL）的超低温保存。

肾脏移植过程不经过冷冻保存血管腔室会受到损伤，需要低温保护剂灌注，选择特定浓度的灌注液配方，温度和缓冲液极为重要[61]。MULLER等[62]提出，在循环死亡和脑死亡后，低温含氧灌注下的器官均比原始移植方法移植的器官在功能维持的情况下有更高的移植成活率。

5 结论

本文研究了仿生型低温保护剂的研究进展及其在生物领域的应用，得出如下结论：

1）低温保护剂在低温生物学合低温保存过程的应用已经相对成熟，在更复杂的组织和器官仍需要进一步研究更有效的保护剂；

2）将来临床需求将推动低温保存向更高水平发展，即细胞的大规模体积保存、组织和器官保存甚至人体保存的探索；

3）仿生型低温保护剂由于生物安全性高，保存效果好，必将应用于更多的领域，同时随着材料科学和生命科学的持续发展，必将有更多的新型仿生型保护剂应用于低温生物领域。