姜黄素减轻脓毒症大鼠肺损伤的作用机制

江端，刘奥杰，凌伟

脓毒症是宿主对感染的反应失调，并产生危及生命的器官功能损伤［1］。脓毒症的发病因素较多，研究发现革兰阴性菌（G-）为主要致病菌，可能与G-中大量的内毒素有关，内毒素可激活Toll 样受体-4放大炎症信号，导致脏器损伤［2-3］。据报道，丝裂原细胞外信号调节激酶/胞外信号调节激酶（MEK/ERK）信号通路在脓毒症所致的急性肺损伤中有重要作用［4］。姜黄素是姜黄属植物块茎中的活性成分，具有抗炎、抗氧化、降血脂、降压、抗菌、解酒护肝、抗肿瘤等药理活性［5-6］。近几年，对于姜黄素的抗炎作用研究较多，研究发现，姜黄素可通过降低脓毒症大鼠炎症水平，保护其肝组织［7］。但姜黄素是否能通过MEK/ERK 信号通路减轻脓毒症大鼠肺损伤尚不清楚，本研究于2018 年8 月至2019 年4月，采用SD 大鼠体外构建脓毒症动物模型，拟观察姜黄素对脓毒症引起肺损伤的保护作用，并初步探究其分子机制，为脓毒症的防治提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 脓毒症大鼠模型的建立雄性、健康SD 大鼠75 只购自南京君科生物工程有限公司，动物生产许可证号SCXK（苏）2019-0112，使用许可证号SYXK（鄂）2018-0005；3 月龄，体质量（200±20）g，SPF 级动物房饲养条件：温度24～26 ℃，相对湿度40%～60%，每12小时光照黑暗交替，适应性喂养3 d后，用于后续实验。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

采用盲肠结扎穿孔术［8］构建脓毒症大鼠模型，术后出现竖毛、乏力、眼眶有黏膜、颤抖等，并通过抽签随机选取2只造模大鼠病理检测显示肺组织明显损伤，提示建模成功［9］。假手术组仅开腹取出盲肠再原位放回，不作结扎、穿孔处理。各组大鼠术后均进行抗休克（腹腔注射40 mL/kg 乳酸钠林格液）、抗感染（抗生素）处理，并注意保暖。

1.2 分组与干预75只雄性SD 大鼠采用随机数字表法分为五组：假手术组（对照），脓毒症组，姜黄素低、中、高剂量组，每组15只。姜黄素低、中、高剂量组分别于脓毒症造模术后24 h 腹腔注射剂量为50、100、200 mg/kg 的姜黄素（上海恒斐生物科技有限公司，纯度≥98%，规格20 mg）［10］；假手术组和脓毒症组大鼠以等量生理盐水替代。观察期间脓毒症组，姜黄素低、中、高剂量组分别有5、2、3、1 只大鼠死亡，假手术组无大鼠死亡，另行造模补齐。

1.3 肺损伤的评价

1.3.1 苏木精-伊红（HE）染色 干预结束后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠并处死，取肺组织，固定于10%甲醛中，经常规石蜡包埋、切片后，HE（上海经科化学科技有限公司）染色，最后中性树脂封片，显微镜（德国莱卡公司）下观察其肺组织形态学变化。

1.3.2 肺组织湿干比 按上述方法取肺组织，用滤纸拭去表面血液，称重即为湿重；再置于烘箱中烘烤72 h至恒重，称重即为干重，湿干比=湿重/干重。

1.3.3 支气管灌洗液中总蛋白和白蛋白含量 参照上述方法取肺组织，用生理盐水灌洗肺组织3次，收集支气管灌洗液，以2 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清检测总蛋白含量，采用BCA 蛋白检测试剂盒（美国Thermo公司）检测总蛋白的含量。

1.3.4 髓过氧化物酶（MPO）活性 参照上述方法取肺组织，冰上匀浆，以2 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清，采用MPO 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）检测MPO的含量。

1.4 肺组织细胞凋亡的检测采用TUNEL 检测测定肺组织细胞凋亡情况，试剂盒购自美国Promega公司，参照上述方法制备肺组织切片，经脱蜡、水化、固定后，添加蛋白酶K 通透组织细胞，室温下孵育15 min；再次固定后，加入平衡液，湿盒反应10 min；加入TUNEL 反应混合液，暗湿盒37 ℃下反应1 h；滴加柠檬酸钠缓冲液终止，反应15 min；浸入过氧化氢封闭15 min；加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶，孵育30 min；进行二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染；梯度脱水、二甲苯透明、中性树脂封片；显微镜下观察肺组织中凋亡细胞数，计数细胞总数及凋亡细胞数（正常肺组织细胞核呈蓝色，凋亡细胞呈棕色），计算凋亡指数（凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%）。

1.5 肺组织中白细胞介素（IL）-6、IL-10 及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量的检测参照上述方法制备肺组织匀浆液，参照酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海群己生物科技有限公司）说明书步骤进行操作，检测肺组织中IL-6、IL-10及TNF-α的含量。

1.6 肺组织中活化胱天蛋白酶（cleaved-caspase）-3、caspase-9、MEK 及ERK 水平的检测采用蛋白质印迹法检测肺组织中相关蛋白表达水平，参照上述方法制备肺组织匀浆液，添加裂解液提取总蛋白，经二喹啉甲酸法（BCA）蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。上样量为30～50 μg，配制10%浓缩胶和5%分离胶，进行凝胶电泳，电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，进行免疫反应，最后暗室中显影、定影。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达为内参，计算cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、磷酸化p）-MEK、MEK、p-ERK 及ERK 的相对表达量，蛋白一抗购自美国Abcam公司。

1.7 统计学方法采用SPSS 19.0 软件进行统计，计量数据均服从正态分布以xˉ±s表示，方差齐，多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织形态的影响HE染色显示，假手术组肺泡结构完整，间隔均匀；脓毒症组大鼠肺泡结构破坏，出现明显扩张，间隔增大，肺泡壁增厚，并有明显的炎症细胞浸润和水肿；姜黄素低、中、高剂量组较假手术组仍有明显的病理改变，但较脓毒症组肺组织损伤明显减轻，炎症细胞浸润现象明显较少。见图1。

图1 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织形态的影响（苏木精-伊红染色×200）

2.2 姜黄素对脓毒症大鼠肺损伤指标的影响与假手术组相比，脓毒症组大鼠肺组织湿干比、MPO含量及肺泡灌洗液中总蛋白量显著上升（P＜0.05）；与脓毒症组相比，姜黄素低、中、高剂量组肺组织湿干比、MPO 含量及肺泡灌洗液中总蛋白量显著下降（P＜0.05），具有浓度依赖性。见表1。

2.3 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡的影响脓毒症组大鼠肺组织凋亡指数、cleaved-caspase-3及cleaved-caspase-9 水平较假手术组明显升高（P＜0.05）；姜黄素低、中、高剂量组凋亡指数、cleavedcaspase-3 及cleaved-caspase-9 水平较脓毒症组明显降低（P＜0.05），具有浓度依赖性。见图2，表2。

2.4 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织炎性因子水平的影响脓毒症组大鼠肺组织IL-6、IL-10 及TNF-α 水平较假手术组明显升高（P＜0.05）；与脓毒症组相比，姜黄素低、中、高剂量组肺组织IL-6、IL-10 及TNF-α水平明显降低（P＜0.05），具有浓度依赖性。见表3。

图2 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织中凋亡相关蛋白的影响

表2 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡指数和凋亡相关蛋白表达的影响/± s

表2 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织细胞凋亡指数和凋亡相关蛋白表达的影响/± s

注：cleaved-caspase为活化胱天蛋白酶。①与假手术组相比，P＜0.05。②与脓毒症相比，P＜0.05。③与姜黄素低剂量组相比，P＜0.05。④与姜黄素中剂量组相比，P＜0.05。

组别假手术组脓毒症组姜黄素低剂量组姜黄素中剂量组姜黄素高剂量组F值P值鼠数1 5 15 15 15 15细胞凋亡率/%3.86±0.67 19.41±2.58①16.27±2.14②12.36±1.62②③8.59±1.26②③④59.41＜0.001 cleaved-caspase-3 0.13±0.05 0.58±0.13①0.45±0.14②0.33±0.12②③0.21±0.11②③④177.87＜0.001 cleaved-caspase-9 0.24±0.06 0.93±0.15①0.72±0.12②0.58±0.13②③0.39±0.10②③④81.64＜0.001

2.5 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织MEK/ERK 信号通路的影响与假手术组相比，脓毒症组大鼠肺组织p-MEK/MEK 和p-ERK/ERK 水平明显升高（P＜0.05）；与脓毒症组相比，姜黄素低、中、高剂量组肺组织中p-MEK/MEK 和p-ERK/ERK 水平明显降低（P＜0.05），具有剂量依赖性。见图3，表4。

3 讨论

急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征是脓毒症最常见的并发症，而急性肺损伤是全身性炎症反应在肺部的表现，主要是炎症细胞及因子的激活，诱发了一系列肺毛细血管和肺泡上皮细胞的损伤，改变毛细血管基底膜通透性，肺血屏障功能出现障碍后，大量富含有蛋白质的液体进入肺泡或肺间质，导致肺水肿［11-12］。MPO 主要是中性粒细胞分泌的血红蛋白，外界刺激激活中性粒细胞后，会释放MPO参与宿主反应，其高表达提示血管损伤严重［13］。本研究发现姜黄素可以改善脓毒症大鼠肺损伤，采用盲肠结扎穿孔术构建脓毒症大鼠模型后，脓毒症组大鼠肺泡结构破坏，出现明显扩张，间隔增大，肺泡壁增厚，并有明显的炎症细胞浸润和水肿，肺组织湿干比、MPO 含量及肺泡灌洗液中总蛋白量显著上升，提示脓毒症大鼠出现明显的肺损伤：肺水肿、肺毛细血管损及肺高渗透性，与Zolali 等［14］研究相似，而姜黄素可明显减轻大鼠肺水肿和肺高渗透性，保护其肺组织。

表1 姜黄素对脓毒症大鼠肺损伤指标的影响/xˉ± s

表3 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织炎性因子水平的影响/± s

表3 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织炎性因子水平的影响/± s

注：IL为白细胞介素，TNF-α为肿瘤坏死因子-α。①与假手术组相比，P＜0.05。②与脓毒症相比，P＜0.05。③与姜黄素低剂量组相比，P＜0.05。④与姜黄素中剂量组相比，P＜0.05。

组别假手术组脓毒症组姜黄素低剂量组姜黄素中剂量组姜黄素高剂量组F值P值鼠数15 15 15 15 15 IL-6/（ng/L）72.46±17.62 224.16±35.21①174.73±26.43②132.85±22.18②③101.74±16.52②③④89.34＜0.001 IL-10/（ng/L）6.25±1.49 27.63±5.81①23.57±4.42②17.34±3.19②③12.78±2.27②③④76.31＜0.001 TNF-α/（μg/L）2.15±0.46 7.54±1.34①5.72±1.02②4.28±0.91②③3.07±0.73②③④77.97＜0.001

图3 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织MEK/ERK信号通路的影响

表4 姜黄素对脓毒症大鼠肺组织p-MEK/MEK、p-ERK/ERK水平的影响/± s

注：p-MEK/MEK 为磷酸化丝裂原细胞外信号调节激酶与丝裂原细胞外信号调节激酶比值，p-ERK/ERK 为磷酸化胞外信号调节激酶与胞外信号调节激酶比值。①与假手术组相比，P＜0.05。②与脓毒症相比，P＜0.05。③与姜黄素低剂量组相比，P＜0.05。④与姜黄素中剂量组相比，P＜0.05。

组别假手术组脓毒症组姜黄素低剂量组姜黄素中剂量组姜黄素高剂量组F值P值鼠数15 15 15 15 15 p-MEK/MEK 0.48±0.07 1.25±0.14①1.08±0.13②0.81±0.15②③0.62±0.12②③④96.81＜0.001 p-ERK/ERK 0.52±0.09 1.34±0.15①1.16±0.14②0.97±0.13②③0.75±0.11②③④99.78＜0.001

本研究发现，姜黄素处理后，脓毒症大鼠肺组织中MEK、ERK 的磷酸化水平显著下降，提示姜黄素可能通过下调MEK/ERK 信号通路，改善脓毒症大鼠肺损伤。促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）家族是体内重要的信号转导通路，几乎参与所有细胞生物学反应，MEK/ERK 是MAPK 家族的重要成员，与细胞凋亡、增殖、分化、炎症反应等过程密切相关［15-16］。但研究发现，根据不同的刺激信号，MEK/ERK 通路对细胞凋亡会有不同的作用；肿瘤细胞中MEK/ERK 激活具有抗凋亡的作用［17］，而急性炎症中MEK/ERK 则有促凋亡作用，如脓毒症等［18］。线粒体途径是细胞凋亡的主要途径，其中caspase-3 和caspase-9 是关键蛋白分子［19］。本研究发现，姜黄素可以显著下调成熟caspase-3和caspase-9水平，抑制脓毒症大鼠肺组织细胞的凋亡。临床研究证实，IL-6、IL-10 及TNF-α 在感染性疾病中有良好的诊断作用［20］。本研究结果显示，姜黄素可显著降低脓毒症大鼠肺组织中IL-6、IL-10 及TNF-α 水平，提示姜黄素可有效改善脓毒症大鼠炎症水平，并缓解其免疫抑制，而减轻肺组织损伤。

综上所述，姜黄素能够改善脓毒症大鼠肺组织病理损伤，减少肺组织细胞的凋亡，减轻炎症反应，下调MEK/ERK 信号通路而保护肺损伤。但其抑制MEK/ERK通路具体的分子通路还需要深入研究，为姜黄素的临床应用提供理论支持。

（本文图1见插图9-1）