黏蛋白4在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及意义

曹顺顺，汪晓龙，舒传继，邵剑杰，李红霞

（1.鄂东医疗集团黄石市中心医院（湖北理工学院附属医院）口腔科，湖北 黄石 435000；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔科，湖北 武汉 430000）

口腔鳞状细胞癌（OSCC）作为口腔癌的主要类型，其发病率呈升高趋势[1]。该病具有侵袭转移性强、预后差的特点[2]。虽然近年来OSCC的临床治疗手段不断在进步，但患者总体预后依然不佳[3]。研究发现，颈淋巴结转移及局部复发是影响患者治疗效果及预后的主要危险因素[4]。因此，积极探讨OSCC的转移及复发机制、寻找敏感基因对指导患者早期诊疗及预后改善意义重大。黏蛋白（MUCs）作为一类相对分子质量高且具有细胞保护及润滑功能的糖蛋白，在机体内广泛存在，参与了细胞分化、细胞间黏附及信号转导、免疫应答等生物学活动[5]。同时，MUC4在不同恶性肿瘤发生中起关键性作用[6]。MUC4作为MUCs的亚型之一，具有癌基因的特性，参与了多种恶性肿瘤的发生过程，其在肿瘤细胞生长、侵袭转移中发挥重要作用[7]。但MUC4是否与OSCC相关，少有报道。本研究对OSCC组织中MUC4蛋白表达进行分析，探讨其在不同临床指标间表达的差异性，以及其与患者预后的相关性。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2012年7月—2015年7月在我院接受手术治疗的OSCC患者。纳入标准：①治疗前未接受任何其他治疗；②经术后病理学检查确诊为OSCC；③临床资料完整，且能按要求完成随访。排除急慢性感染、血液或免疫系统疾病、合并有其他系统恶性肿瘤的患者。共纳入病例89例，其中男性49例，女性40例，年龄31～74岁，平均年龄 （59.12±10.35）岁。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ～Ⅳ期52例；分化程度：低分化33例，中分化25例，高分化31例；发生淋巴结转移者36例。术中留取肿瘤组织及瘤周正常癌旁组织（距离肿瘤边缘2 cm以上），均用10%甲醛固定，石蜡包埋保存。本研究通过医院伦理委员会批准（批准号：HBSHSSZXYY2011030 6009），所有患者均知情同意本研究。

1.2 主要试剂和设备

兔抗人MUC4多克隆抗体（上海酶联生物科技有限公司，中国）；SP免疫组织化学试剂盒、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记二抗、二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司，中国）；二甲苯、3%过氧化氢（广州翔博生物科技有限公司，中国）；苏木精、中性树脂（武汉博士德生物工程有限公司，中国）；全自动石蜡切片机（上海亚晶生物科技有限公司，中国）；光学显微镜（Olympus公司，日本）。

1.3 临床资料收集

收集OSCC患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史等一般资料，以及肿瘤部位、肿瘤直径、TNM分期、分化程度及淋巴转移情况等指标，分析MUC4蛋白与这些资料的相关性。

1.4 免疫组织化学SP法检测组织中MUC4蛋白的表达

取石蜡标本，按4μm厚度切片，用二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，用磷酸缓冲溶液（phosphate buffer solution,PBS）冲洗3次，高压高温下行抗原修复10 min，浸入3%过氧化氢10 min使内源性过氧化物酶灭活，封闭25 min。将一抗兔抗人MUC4多克隆抗体按1∶600的比例稀释后加入，4℃下过夜孵育，加入生物素标记二抗，室温反应60 min，用PBS冲洗3次，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，用中性树脂封片，显微镜下观察，以PBS替代一抗作为阴性对照。采用半定量法[8]对结果进行判定：MUC4蛋白主要表达于细胞膜或细胞质中，以出现淡黄色或黄褐色团块状物质为阳性，随机选取高倍镜下5个视野，分别根据阳性细胞数和染色强度进行判定。①染色情况：未染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，黄褐色为3分；②阳性细胞情况：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；③根据①和②的乘积判断结果：0～2分为阴性表达，＞2分为阳性表达。

1.5 随访

患者于术后开始随访，包括住院期间查房及出院后门诊复查、电话随访等，随访截至2020年7月31日，随访终止事件为患者死亡或者随访满5年，记录患者生存时间和5年生存率。

1.6 统计学分析

使用SPSS 21.0软件进行数据整理分析，计数资料以例（%）表示，采用χ2检验进行组间比较，使用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析，应用logrank检验对患者5年生存率进行比较，使用多因素Cox比例风险模型分析影响患者生存时间的相关因素，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OSCC组织和癌旁组织中MUC4蛋白的表达

MUC4蛋白在OSCC组织中阳性表达65例，阳性率为73.03%，在癌旁组织中阳性表达18例，阳性率为20.22%，差异有统计学意义（χ2=49.867，P＜0.001）。组织学图片见图1。

图1 免疫组织化学SP法检测OSCC组织和癌旁组织中MUC4蛋白的表达（×200）Figure 1 Detection of MUC4 protein expression in OSCC and adjacent tissues by immunohistochemistry(×200)

2.2 MUC4蛋白表达与OSCC患者临床指标的相关性

MUC4蛋白在不同性别、年龄、肿瘤部位、吸烟史、饮酒史、肿瘤直径的OSCC患者中阳性表达率的差异无统计学意义（P＞0.05）。MUC4蛋白在TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期，低、中分化及发生淋巴结转移OSCC患者中的阳性表达率分别高于Ⅰ～Ⅱ期、高分化及未发生淋巴结转移的患者，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。

表1 MUC4蛋白表达与OSCC患者临床指标的相关性[n（%）]Table 1 Correlation between MUC4 protein expression and clinical indicators in OSCC patients[n(%)]

2.3 MUC4蛋白表达与OSCC患者预后的相关性

89例患者随访时间为1～60个月，MUC4蛋白阴性表达组患者平均生存时间为（47.00±3.35）个月、5年生存率为58.33%，阳性表达组分别为（24.94±2.40）个月和20.00%，log-rank检验差异有统计学意义（χ2=15.358，P＜0.001）。详见图2。

图2 Kaplan-Meier法分析MUC4蛋白表达对OSCC患者预后的影响Figure 2 Analysis of MUC4 protein expression on the prognosis of OSCC patients by Kaplan-Meier method

2.4 OSCC患者生存时间的影响因素

将临床指标性别、年龄、肿瘤部位、吸烟、饮酒、肿瘤直径、TNM分期、分化程度、淋巴结转移和MUC4表达作为自变量纳入多因素Cox比例风险模型，结果显示，TNM分期、分化程度、淋巴结转移和MUC4蛋白表达是影响OSCC患者生存时间的独立风险因素（表2，P＜0.05）。排除其他指标，单独将MUC4表达纳入Cox比例风险模型，结果显示，MUC4蛋白表达是影响OSCC患者生存时间的的风险因素[HR=3.487（95%CI：1.762～6.899），P＜0.05]。

3 讨论

OSCC作为最常见的口腔恶性肿瘤，发病机制复杂，是多因素、多基因、多步骤、多机制共同参与的结果，易向周围组织浸润生长，且早期便可出现淋巴结转移，外科手术、放化疗、靶向生物治疗等治疗手段不断在进步，但复发和转移依然是导致患者死亡的主要原因[9]。MUC4是跨膜型膜结合MUCs家族的重要成员，可表达于多种上皮组织，对上皮具有保护和润滑的作用[10]。近年来的研究发现，MUC4的异常表达与恶性肿瘤的发生、进展关系密切[11]；MUC4在子宫内膜癌[12]、宫颈鳞癌[13]、脑膜瘤[14]等多种恶性肿瘤组织中表达升高，且参与了肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭过程[15]。有研究指出，MUC4通过整合素-β1/FAK/ERK信号通路促进前列腺癌（prostate cancer，PC）的发生[16]。周转转等[17]指出，MUC4通过抗黏附、逃避免疫识别和影响细胞信号转导通路等参与肿瘤的发生、发展、转移及增殖，进而影响患者的预后。本研究结果显示，MUC4蛋白在OSCC组织中的阳性表达率明显高于其在癌旁组织中，说明OSCC组织中出现了MUC4蛋白的异常表达，提示MUC4可能参与了OSCC的发生过程。本研究结果显示，MUC4蛋白在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期，低、中分化和发生淋巴结转移的OSCC患者中的阳性表达率高于其在Ⅰ～Ⅱ期、高分化和未发生淋巴结转移的患者中，说明MUC4蛋白的高表达与患者较差的临床指标相关，MUC4可能通过发挥癌基因的功能参与了OSCC的进程。

有研究指出，MUC4表达与肺腺癌不良预后相关[18]。Yu等[19]指出，MUC4高表达是黑色素瘤患者总生存期的独立预后因素。刘鑫宇等[20]则指出，MUC4蛋白阳性的结石相关肝内胆管细胞癌患者术后生存率明显降低。本研究结果显示，MUC4蛋白阴性表达组患者平均生存时间和5年生存率均高于阳性表达组，说明MUC4蛋白与OSCC患者预后明显相关，MUC4蛋白阳性表达患者5年生存率更低。本研究多因素分析结果显示，TNM分期、分化程度、淋巴结转移和MUC4蛋白表达是影响OSCC患者生存时间的的独立风险因素，该结果进一步说明MUC4蛋白表达是影响患者预后的因素，可能是评估患者预后的潜在生物学标志物。

综上所述，MUC4蛋白在OSCC患者组织中呈高表达，且与TNM分期、分化程度和淋巴结转移相关，可能是评估患者预后的潜在生物学标志物，但其具体的促癌机制尚需进一步明确。