静态牵张力对人炎症牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响及分子机制探究

喻 莉，杨 静，宋泰来

（西安市第三医院口腔科，陕西 西安 710000）

牙周膜干细胞（PDLSCs）是牙周组织再生领域重要的种子细胞。在正畸治疗过程中，正畸牵张力对PDLSCs增殖及成骨分化的调控有利于牙槽骨的重塑[1-2]。有研究报道，10%、12%、14%静态牵张力（SMS）对健康PDLSCs的增殖及成骨分化具有促进作用，能够为正畸牙齿移动及牙槽骨重塑创造有利的局部微环境；但合并牙周炎的患者在接受正畸治疗时，炎症PDLSCs在相同程度SMS的作用下会出现增殖及成骨分化受抑制的状况，不利于正畸牙齿的移动[3-4]。目前，10%、12%、14%SMS抑制炎症PDLSCs增殖及成骨分化的机制尚不十分清楚。

国内学者采用芯片技术检测了炎症PDLSCs在SMS作用前后长链非编码RNA（lncRNA）表达的变化，发现linc00638、Uc011jsq.2、AK021458 3种lncRNAs的变化最为显著[5]。微小RNA（microRNA，miR）-29a是一种对间充质干细胞成骨分化具有促进作用的miR[6]，笔者通过生物信息学分析发现linc00638对miR-29a具有靶向调控作用。基于此提出假设，炎症PDLSCs在SMS作用下高表达的linc00638可能靶向miR-29a并削弱其促进成骨分化的作用，进而抑制炎症PDLSCs的成骨分化。为了验证这一假设，本研究将以linc00638/miR-29a轴为切入点，研究14%SMS对人炎症PDLSCs增殖及成骨分化的影响及分子机制。

1 材料和方法

1.1 临床样本

收集我院2019年3月—2021年3月期间因正畸治疗拔除的健康牙齿8颗及牙周炎牙齿8颗。健康牙齿组男性5例、女性3例，年龄（33.48±6.28）岁；牙周炎牙齿组男性4例、女性4例，年龄（33.71±8.12）岁。本研究均取得患者知情同意。

1.2 试剂

阴性对照（NC）shRNA慢病毒、linc00638 shRNA慢病毒、miR-NC慢病毒、miR-29a抑制物慢病毒（北京英茂盛业生物公司，中国）；miR-NC、miR-29a（上海吉玛生物公司，中国）；linc00638野生型及突变型双荧光素酶报告基因及检测系统（Promega公司，丹麦）；MTS法细胞增殖检测试剂盒（Biovision公司，美国）；地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、茜素红（Sigma公司，美国）；RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、lncRNA及miR荧光定量检测试剂盒（北京天根生化公司，中国）。

1.3 仪器

细胞培养箱（Thermo公司，美国）；酶标仪（Biotek公司，美国）；荧光定量PCR仪（Bio-rad公司，美国）。

1.4 方法

1.4.1 PDLSCs的培养及鉴定 将健康牙齿和牙周炎牙齿放入4℃无菌的磷酸盐缓冲液中，在超净台下进行牙齿清洗，无菌条件下刮取牙根中1/3的牙周膜组织，加入3 mg/mL的Ⅰ型胶原酶，没过组织块，37℃下消化1 h，随后加入等体积含有10%胎牛血清的培养液以终止消化，组织悬液在离心机中以800 r/min的速度离心5 min，弃去上清液，保留沉淀，用含有10%胎牛血清的培养液重悬并接种在培养皿中，贴壁培养3～7 d。当细胞从组织块周围爬出且密度达到90%后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取第3代PDLSCs并采用流式细胞术进行干细胞特性鉴定，分别对干细胞标志物CD29、CD105进行检测，阳性率均达到99%以上。

1.4.2 PDLSCs的分组及干预 取第3代PDLSCs，按3×105个/孔的密度将其接种在Bioflex 6孔板中并进行分组，分组实验分为3个部分。

第1部分实验探究不同程度SMS的生物学效应：对照组不给予SMS；在FX-4000T牵张力加载系统上给予SMS，10%、12%、14%SMS组分别给予力值10%、12%、14%及频率0.1 Hz的SMS干预。各组均持续12 h。

第2部分实验探究linc00638在14%SMS中的作用：细胞分为sh-NC组、sh-NC+14%SMS组、shlinc00638+14%SMS组，分别进行NC shRNA慢病毒、linc00638 shRNA慢病毒感染[感染复数(multiplicity of infection，MOI)=30]，感染72 h后在FX-4000T牵张力加载系统上给予14%SMS，持续12 h。

第3部分实验探究miR-29a在linc00638调控中的作用：细胞分为sh-NC+miR-NC组、sh-NC+miRNC+14%SMS组、sh-linc00638+miR-NC+14%SMS组、sh-linc00638+miR-29a+14%SMS组，分别进行NC shRNA慢病毒联合miR-NC慢病毒、linc00638 shRNA慢病毒联合miR-NC慢病毒、linc00638 shRNA慢病毒联合miR-29a抑制物慢病毒感染（MOI=30），感染72 h后在FX-4000T牵张力加载系统上给予14%SMS，持续12 h。

1.4.3 细胞增殖的检测 各组细胞加载SMS 12 h后进行细胞增殖的检测，每孔加入MTS法检测液500μL，继续孵育4 h后充分混匀，每孔取50μL液体加入96孔培养板内，在酶标仪上检测405 nm波长处的吸光度值（A405）。

1.4.4 细胞成骨分化的诱导及检测 配制含有0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C、10%胎牛血清的成骨诱导培养液，应用SMS干预12 h后更换为成骨诱导培养液，进行成骨诱导分化。诱导分化过程中，每2天更换1次成骨诱导培养液。第14天时，收集细胞并进行漂洗，用0.1%茜素红在37℃下染色30 min，在显微镜下观察钙结节形成情况并拍照记录，而后加入10%氯化十六烷基吡啶（500μL/孔），使钙结节充分溶解后取50μL液体加入96孔培养板内，在酶标仪上检测490 nm波长处的吸光度值（A490）。

1.4.5 linc00638、mi R-29a表达的检测 各组细胞加载SMS 12 h后进行linc00638、miR-29a表达的检测。首先采用RNA提取试剂盒分离得到细胞中的RNA，而后采用cDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录合成为cDNA，最后分别采用lncRNA及miR荧光定量检测试剂盒对linc00638及miR-29a进行荧光定量PCR扩增，同时也对内参U6进行荧光定量PCR扩增。扩增反应程序如下：95℃15 min，94℃20 s、60℃34 s，重复40个循环。反应结束后生成循环曲线并得到循环阈值，以U6为内参，计算linc00638、miR-29a的表达水平。

1.4.6 在线生物信息学分析 在Starbase3.0网站（https://starbase.sysu.edu.cn）进行在线生物信息学分析，输入linc00638的基因信息，分析linc00638序列中与miR-29a互补配对结合的碱基位点。

1.4.7 双荧光素酶报告基因实验 在24孔培养板内接种炎症PDLSCs，将linc00638野生型及突变型双荧光素酶报告基因与miR-NC或miR-29a共同转染进入细胞，24 h后采用双荧光素酶报告基因检测系统对细胞内的海肾荧光值及萤火虫荧光值进行检测，按照公式（荧光活力=萤火虫荧光值/海肾荧光值）计算报告基因的荧光活力。

1.4.8 统计学方法 采用SPSS 21.0软件录入数据并进行统计学分析，实验数据均为计量资料，以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，差异有统计学意义的资料进一步采用LSD-t检验两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 10%、12%、14%SMS对健康PDLSCs及炎症PDLSCs增殖及成骨分化的影响

在健康PDLSCs中，与对照组比较，10%、12%、14%SMS组的增殖A490、茜素红A405均明显增加（P＜0.05），且随SMS越大，增殖A490、茜素红A405越高；在炎症PDLSCs中，与对照组比较，10%、12%、14%SMS组的增殖A490、茜素红A405均明显降低（P＜0.05），且随SMS越大，增殖A490、茜素红A405越低。详见图1。

图1 各组健康PDLSCs及炎症PDLSCs增殖及成骨分化的比较Figure 1 Comparison of proliferation and osteogenic differentiation between healthy PDLSCs and inflammatory PDLSCs in each group

2.2 10%、12%、14%SMS对健康PDLSCs及炎症PDLSCs中linc00638、miR-29a表达水平的影响

在健康PDLSCs中，对照组linc00638、miR-29a表达水平与10%、12%、14%SMS组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；在炎症PDLSCs中，与对照组比较，10%、12%、14%SMS组linc00638的表达水平明显增加，miR-29a的表达水平明显降低（P＜0.05），且随SMS越大，细胞中linc00638表达水平越高、miR-29a表达水平越低。详见图2。

图2 各组健康PDLSCs及炎症PDLSCs中linc00638、miR-29a表达水平的比较Figure 2 Comparison of linc00638 and miR-29a expression levels betweem healthy PDLSCs and inflammatory PDLSCs in each group

2.3 敲低linc00638对14%SMS调控炎症PDLSCs增殖及成骨分化的影响

与sh-NC组比较，sh-NC+14%SMS组炎症PDLSCs中linc00638的表达水平明显增加，增殖A490、茜素红A405均明显降低（P＜0.05）；与sh-NC+14%SMS组比较，sh-linc00638+14%SMS组炎症PDLSCs中linc00638的表达水平明显降低，增殖A490、茜素红A405均明显增加（P＜0.05）。详见图3。

图3 敲低linc00638对14%SMS调控炎症PDLSCs增殖及成骨分化的影响Figure 3 Effect of knockdown of linc00638 on 14%SMS regulating proliferation and osteogenic differentiation of inflammatory PDLSCs

2.4 敲低linc00638对14%SMS调控炎症PDLSCs中miR-29a表达的影响

与sh-NC组比较，sh-NC+14%SMS组炎症PDLSCs中miR-29a的表达水平明显降低（P＜0.05）；与sh-NC+14%SMS组比较，sh-linc00638+14%SMS组炎症PDLSCs中miR-29a的表达水平明显增加（P＜0.05）。详见图4。

图4 敲低linc00638对14%SMS调控炎症PDLSCs中miR-29a表达的影响Figure 4 Effect of knockdown of linc00638 on 14%SMS regulating miR-29a expression in inflammatory PDLSCs

2.5 炎症PDLSCs中linc00638靶向miR-29a的生物信息学及双荧光素酶报告基因验证

linc00638靶向miR-29a的生物信息学预测分析结果见图5A；与miR-NC组比较，miR-29a组炎症PDLSCs中野生型linc00638报告基因的荧光活力明显降低（P＜0.05），突变型linc00638报告基因的荧光活力无明显变化（P＞0.05）。详见图5。

图5 炎症PDLSCs中linc00638靶向miR-29a的验证Figure 5 Validation of linc00638 targeting miR-29a in inflammatory PDLSCs

2.6 抑制miR-29a对敲低linc00638促进14%SMS作用下炎症PDLSCs增殖及成骨分化的影响

与sh-NC+miR-NC组比较，sh-NC+miR-NC+14%SMS组炎症PDLSCs的miR-29a表达水平、增殖A490、茜素红A405均明显降低（P＜0.05）；与sh-NC+miR-NC+14%SMS组比较，sh-linc00638+miR-NC+14%SMS组炎症PDLSCs中的miR-29a表达水平、增殖A490、茜素红A405均明显增加（P＜0.05）；与shlinc00638+miR-NC+14%SMS组比较，sh-linc00638+miR-29a+14%SMS组炎症PDLSCs的miR-29a表达水平、增殖A490、茜素红A405均明显降低（P＜0.05）。详见图6。

图6 抑制miR-29a对敲低linc00638促进14%SMS作用下炎症PDLSCs增殖及成骨分化的影响Figure 6 Effects of miR-29a inhibition on knockdown of linc00638 promoting proliferation and osteogenic differentiation of inflammatory PDLSCs intervened by 14%SMS

3 讨论

PDLSCs是存在于牙周组织中的间充质干细胞，其具有自我更新及多向分化的潜能，参与牙周组织的再生和修复。在正畸治疗过程中，正畸牙齿移动与正畸力作用下牙槽骨的改建有关，PDLSCs在正畸力作用下发生成骨分化在牙槽骨改建中起重要作用[7-8]。临床研究证实，与牙周组织健康的正畸患者比较，牙周炎患者对相同等级正畸力的反应较为缓慢[9-10]，可能的原因是炎症状态下PDLSCs对正畸力的耐受性下降，其在正畸力作用下发生的增殖及成骨分化均会受到影响，进而不利于牙槽骨的改建及正畸牙齿的移动。

国内外的多项正畸与PDLSCs相关的细胞实验发现，10%～14%SMS对健康PDLSCs的增殖和成骨分化均具有促进作用，但同等级的SMS对炎症PDLSCs的增殖和成骨分化却产生抑制作用[3-4]。这些研究的结果与临床上牙周炎患者在正常正畸力作用下牙齿移动缓慢的现状相吻合。本研究也对不同SMS作用下健康PDLSCs与炎症PDLSCs的差异表现进行了验证，给予10%～14%的SMS干预12 h后，健康PDLSCs的增殖活力及成骨分化水平均明显增强，炎症PDLSCs的增殖活力及成骨分化水平均明显减弱，上述结果与国内外已有的研究结果[3-4]一致，但炎症PDLSCs在10%～14%SMS作用下，增殖及成骨分化受抑制的分子机制尚不十分清楚。

表观遗传学机制是近些年干细胞成骨分化相关机制的研究热点，lncRNAs及miRs在转录后水平实现基因表达的表观遗传学调控[11-13]。秦文等[5]通过芯片技术发现多种lncRNAs的差异表达与SMS作用下炎症PDLSCs生物学特性的变化有关，其中linc00638是SMS干预后表达差异显著的lncRNA之一。Zhang等[14]和Wen等[15]的2项研究分别在椎间盘退行性变及关节滑膜炎症改变中证实，linc00638发挥了生物学作用。本研究在SMS干预后检测到炎症PDLSCs中linc00638表达明显增加，而健康PDLSCs中linc00638表达无明显变化。健康及炎症PDLSCs在SMS作用下，linc00638表达的差异可能是造成细胞增殖及成骨分化差异的分子机制。为了验证linc00638在SMS作用下炎症PDLSCs增殖及成骨分化中的调控作用及机制，本研究通过慢病毒感染的方式敲低linc00638的表达，在敲低linc00638后进行14%SMS的干预，结果发现细胞增殖活力及成骨分化均明显增强，表明SMS作用下linc00638表达增加对炎症PDLSCs的增殖和成骨分化具有抑制作用。

LncRNA能够通过“分子海绵”的作用机制吸附miR、削弱miR对靶基因的调控作用，进而产生不同的生物学效应。在间充质干细胞增殖及成骨分化过程中，miR-29a是起到促进作用的miR[16-17]。本研究通过在线生物信息学分析已经预测linc00638中存在与miR-29a互补配对的序列，同时双荧光素酶报告基因实验证实，miR-29a能够使linc00638野生型报告基因的荧光活力降低，表明linc00638靶向miR-29a并通过“分子海绵”的作用吸附miR-29a。基于此，本研究进一步分析了linc00638/miR-29a轴在调控炎症PDLSCs增殖及成骨分化中的作用。在SMS干预后，炎症PDLSCs中miR-29a的表达水平明显降低，而健康PDLSCs中miR-29a的表达水平无明显变化，这与炎症及健康PDLSCs在SMS作用下linc00638表达的变化趋势一致。在敲低linc00638的同时抑制miR-29a，而后进行14%SMS干预，结果发现通过敲低linc00638，14%SMS对炎症PDLSCs增殖及成骨分化的促进作用发生逆转，表明linc00638调控炎症PDLSCs增殖及成骨分化的作用与miR-29a有关。

综上所述，炎症PDLSCs在SMS作用下增殖及成骨分化能力减弱会影响牙周炎患者的正畸效果。本研究通过细胞实验初步探究了炎症PDLSCs在SMS加载下增殖及成骨分化减弱的分子机制，linc00638/miR-29a轴在这一过程中发挥重要调控作用。SMS作用于炎症PDLSCs能够增加linc00638的表达，通过linc00638的“分子海绵”作用机制与miR-29a结合，进而削弱miR-29a促进干细胞增殖及成骨分化的作用，最终抑制炎症PDLSCs的增殖及成骨分化。这为今后深入认识牙周炎患者正畸牙齿移动慢的分子机制提供了实验依据，也为促进牙周炎患者正畸过程中PDLSCs的增殖及成骨分化提供了新的治疗思路。