乌蒙凤鸡与贵州4个不同地方鸡种的分子系统学鉴定

徐龙飞， 张开学， 赵 飘， 王月霞*

(1. 六盘水师范学院，贵州 六盘水 553004； 2. 织金县农业农村局，贵州 织金 552100)

乌蒙凤鸡是六盘水市水城区红岩乡苗族同胞世代驯养的地方鸡种，因冠羽较发达，鸡头像凤凰而得名，具有觅食性能好，野外生存能力强，肉味鲜美等特点。该鸡种由六盘水市农委畜牧技术推广站于2013年发现并进行保种、扩繁和选育，目前已发展至近20 000羽。乌蒙凤鸡是乌蒙山区地方鸡种质新资源，目前国内外尚无乌蒙凤鸡与贵州其他地方鸡亲缘关系的研究报道。本研究应用分子系统学的DNA条形码技术(DNA Barcoding)分析乌蒙凤鸡与威宁鸡、高脚鸡、缘凤土鸡、乌蒙乌骨鸡4个乌蒙山区常见地方鸡种的亲缘关系，为该鸡种的分子生物学鉴定方法和原始种群的扩繁、选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料乌蒙凤鸡、威宁鸡、高脚鸡、缘凤土鸡、乌蒙乌骨鸡由六盘水市农委畜牧技术推广站提供。分别采集5个地方鸡种的腿部皮下组织10 g，浸于无水乙醇离心管中-80 ℃保存[1]。

1.2 主要试剂Buffer TL、Buffer BL、Buffer GW、Buffer EB、Buffer PP、96%～100%乙醇、ddH2O、GoldViewⅠ型核酸染色剂、EDTA-Na2、Tris缓冲溶液、动物组织基因组DNA提取试剂盒D1700(均购自北京索莱宝科技有限公司)；MarkerⅡ、2×TaqPCR Master MiX[均购自天根生化科技(北京)有限公司]。

1.3 引物(1)2组通用引物为P7/P8，BDNF-F/BDNF-R[2，3]。(2)采用Vector NTI Advan 10软件对5个鸡种基因组DNA的重测序存在SNP差异的2个区域设计2对引物；参考序列为鸡的全基因序列(NCBI登录号：AC270448.1)。2对设计引物由武汉百捷斯生物科技有限公司合成，引物信息见表1[4]。

表1 2对设计引物序列信息

1.4 方法

1.4.1 DNA提取参照鲍毅新等[5]、董明等[6]的动物组织DNA提取方法提取组织样品的基因组DNA。

1.4.2 PCR扩增及测序采用通用引物P7/P8，BDNF-F/BDNF-R进行第1次目的基因扩增。采用突变位点的DNA设计引物进行第2次目的基因扩增。PCR反应体系总体积50 μL：上、下游引物引物各2 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共32个循环；72 ℃终延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物。PCR扩增产物电泳目的条带明亮、无杂带，分子量大小通过MarkerⅡ比较判断与预期设计的大小相同，则送至武汉百捷斯生物科技有限公司测序。

1.4.3 基因组DNA测序将5个不同地方鸡种的基因组DNA送至北京百迈客生物科技有限公司测序，使用DNA序列分析软件bowtie和samtools获得 5个不同地方鸡种基因组DNA的SNP位点[7～9]。参考相关文献，并用MEGA6.0软件构建系统发育树[10～12]。

2 结果与分析

2.1 第1次目的基因扩增产物序列分析引物P7/P8扩增的5个不同地方鸡种的线粒体DNA基因组(Gallus mitochondrial DNA complete genome)基因片段无差别，引物BDNF-F/BDNF-R扩增的5个不同地方鸡种的脑源性神经营养因子(Gallus gallus brain-derived neurotrophic factor)基因片段也无差别(见图1)。

图1 第1次目的基因扩增产物序列

2.2 第2次目的基因扩增产物序列分析2组引物扩增目的基因片段有差异(见图2)，可以构建亲缘关系树及计算遗传距离[13]。

图2 第2次目的基因扩增产物序列

2.3 构建单基因分子系统发育树

2.3.1 03号引物扩增PCR产物构建系统发育树根据分子系统学分类，基于03号引物扩增的5个不同地方鸡种PCR产物构建系统发育树(见图3)，表明乌蒙凤鸡与威宁鸡聚为1支，支持率为98%。

图3 基于03号引物扩增的5个不同地方鸡种PCR产物系统发育树注：支系旁的数值表示各支系的最大支持率，下图同

2.3.2 07号引物扩增PCR产物构建系统发育树基于07号引物扩增的5个不同地方鸡种PCR产物构建系统发育树(见图4)，表明乌蒙凤鸡与高脚鸡聚为1支，支持率为69%。

图4 基于07号引物扩增的5个不同地方鸡种PCR产物系统发育树

2.4 构建多基因分子系统发育树由于单基因分子系统发育树所得出的结果差异较大，且支持率不高，所以将比对后的各个基因分别首尾相连，以同样方法构建多基因分子系统发育树(见图5)。结果表明乌蒙凤鸡与威宁鸡聚为1支，支持率为82%。

图5 基于2个基因合并序列的5个不同地方鸡种系统发育树

2.5 遗传距离分析

2.5.1 03号引物扩增的5个不同地方鸡种遗传距离由表2可见：乌蒙凤鸡与威宁鸡的遗传距离为0，与乌蒙乌骨鸡、高脚鸡的遗传距离为0.005，与缘凤土鸡的遗传距离为0.007。乌蒙凤鸡与威宁鸡的遗传距离最近，与缘凤土鸡的遗传距离最远。遗传距离为0的物种可认为是同一物种或者碱基差异不大。

表2 03号引物扩增的5个不同地方鸡种遗传距离

2.5.2 07号引物扩增的5个不同地方鸡种遗传距离由表3可见：乌蒙凤鸡与高脚鸡的遗传距离为0.001，与威宁鸡、缘凤土鸡的遗传距离为0.003，与乌蒙乌骨鸡的遗传距离为0.024。乌蒙凤鸡与高脚鸡的遗传距离最近，与乌蒙乌骨鸡的遗传距离最远。

表3 07号引物扩增的5个不同地方鸡种遗传距离

2.5.3 2个基因合并序列的5个不同地方鸡种遗传距离由表4可见：乌蒙凤鸡与威宁鸡的遗传距离为0.001，与高脚鸡的遗传距离为0.003，与缘凤土鸡的遗传距离为0.005，与乌蒙乌骨鸡的遗传距离为0.014。乌蒙凤鸡与威宁鸡的亲缘关系最近，与乌蒙乌骨鸡的亲缘关系最远。

表4 2个基因合并序列的5个不同地方鸡种遗传距离

3 结论

通过2个基因合并序列的系统发育树和遗传距离综合分析，乌蒙凤鸡与威宁鸡的亲缘关系最近，与乌蒙乌骨鸡的亲缘关系最远。

4 讨论

采用DNA条形码分析的初衷是用最简单且可行的方法来鉴定物种。然而生物界的复杂性通常难以找到1种适用于所有类群的分子标记，所以必须根据不同的类群设计出不同的分子标记。另外，单一标记不论是来自叶绿体基因组、线粒体基因组还是核基因组，都存在错误鉴定的危险。如果采用多基因标记，产生错误的概率将会显著降低。通过构建系统发育树分析表明，单基因与多基因的分子系统学鉴定结果差异较大，虽然通过双向测序及人工编辑，但其中还存在一些不明确的碱基序列，还需要增加样品个数来校正测序误差及鸡种不纯造成的误差。本研究通过分子系统学综合分析，在系统发育树中乌蒙凤鸡与威宁鸡亲缘关系最近，但支持率不高，仅为82%，所以对其分子生物学鉴定还有待于进一步研究核实。