柴胡皂苷A通过LKB1-AMPK通路干预高脂血症大鼠的作用机制研究*

杜昊炎，张 敏，李闪闪，张明昊，春 花，吴宗耀

(1.商丘市中医院，河南 商丘 476000；2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000；3.河南中医药大学，河南 郑州 450046；4.西藏藏医药大学，西藏 拉萨 850000)

高脂血症是一种体内脂肪代谢异常导致的疾病，其主要临床特征是血液中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低[1]。根据流行病学调查，美国约33.5%的成年人血清总胆固醇水平升高(≥2.40 g/L)[2]，亚洲大多数国家因血脂水平升高并发的慢性病导致死亡率也在逐年上升，在中国血脂异常发生人数高达1.6亿[3]。目前越来越多的研究证实，高脂血症是动脉粥样硬化[4]、脑血栓[5]、冠心病[6]、心肌梗死[7]等心脑血管疾病的重要危险因素，故调节血脂水平能有效降低多种慢性疾病的发生[8]。目前，世界上应用最广泛的降血脂药物是他汀类药物，其不仅能有效调节肝脏中胆固醇合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)中的限速酶来降低胆固醇水平，还能促进血脂代谢，但长期使用会造成肝肾功能、肌肉损害，并且还有诱发糖尿病的风险，停药后还会出现血脂水平反跳等不良反应[9]，严重影响疾病的治疗，导致心脑血管疾病等多种并发症的发生，给生命健康带来危害。中药治疗高脂血症疗效显著，无明显不良反应[10]。已经证实小柴胡汤[11]、大柴胡汤[12]等含柴胡的中药复方有较好的降血脂作用，但中药复方成分复杂、分子机制不清严重阻碍了疾病的治疗。柴胡皂苷A是柴胡的主要有效成分,能通过调节脂代谢来调节血脂水平，而肝激酶B1(LKB1)/单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)通路已经被多项研究[13]证实与脂肪代谢密切相关。AMPK是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，能维持细胞能量稳态，参与细胞能量代谢，调节脂质代谢。LKB1作为AMPK上游主要激酶，能磷酸化激活AMPK参与脂肪的能量代谢。因此，本研究对柴胡皂苷A的降血脂作用及机制展开研究，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

雄性SD大鼠60只，体质量180～200 g，鼠龄8周，由郑州市惠济区华兴实验动物养殖场提供，许可证号SCXK(豫)2019-0002，动物使用许可证号SYXK(豫)2020-0004。本研究经河南中医药大学动物伦理委员会批准，批准号DWLL20180018。

1.2 药品、试剂与仪器

柴胡皂苷A，上海源叶生物科技有限公司产品，批号S25577；辛伐他汀片，华润双鹤利民药业(济南)有限公司，产品批号1810409，10 mg/片。氨基甲酸乙酯，天津百伦斯生物技术有限公司产品，批号20200326；TG测定试剂盒、T-C测定试剂盒、HDL-C测定试剂盒、LDL-C测定试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品，批号分别为A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1、A113-1-1；兔SP试剂盒、DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司产品，批号分别为SP-9001、ZLI-9018；BCA蛋白定量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，武汉赛维尔生物科技有限公司产品，批号分别为G2026、G2003；兔抗大鼠AMPK、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、LKB1、HMGCR抗体，均为北京博奥森生物技术有限公司产品，批号分别为bs-10344R、bs-12972R、bs-3948R、bs-5068R。BS110S型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司产品；MR-96TB酶标仪，骋克仪器(上海)有限公司产品；RM2235石蜡切片机，德国徕卡公司产品；D3024R型台式高速冷冻型微量离心机，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司产品；YD-6D型组织包埋机、YD-A型组织摊片机、YD-B型组织烤片机，均为金华市科迪仪器设备有限公司产品；CX23光学显微镜，日本奥林巴斯公司产品；CFX型荧光定量PCR仪，美国伯乐公司产品；Nano Drop 2000型超微量分光光度计，赛默飞世尔科技公司产品。

1.3 动物分组、模型的建立与给药

将60只雄性SD大鼠按体质量随机分为正常组、模型组、辛伐他汀组和柴胡皂苷低、中、高剂量组，每组10只。适应性喂养1周后，除正常组外，其他各组饲喂高脂饲料(白糖占10%、猪油占10%、蛋黄粉占10%、胆固醇占2%、基础饲料占68%)，正常组大鼠常规饲养，连续喂养4周。造模同时，辛伐他汀组大鼠按9 μg/g给药，柴胡皂苷低、中、高剂量组分别按5、10、20 μg/g给药，灌胃体积均为10 μL/g；正常组和模型组给予等体积生理盐水。各组均1次/d，连续4周。

1.4 检测指标

末次给药后，各组大鼠禁食不禁水12 h，以氨基甲酸乙酯1 g/kg体质量腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，解剖取肝脏。

1.4.1 TC、TG、HDL-C、LDL-C

4 ℃下，离心半径10 cm，3 000 r/min转速离心10 min，分离大鼠血清，按照试剂盒操作步骤检测血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。

1.4.2 肝组织病理学形态

取大鼠同位置肝组织，以质量分数40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察肝组织病理学形态。

1.4.3 肝组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白水平

采用免疫组织化学法检测肝组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表达部位及表达情况。肝组织病理切片经脱蜡、水化后，H2O2封闭，PBS清洗，柠檬酸盐缓冲液热修复，山羊血清封闭，室温孵育，分别滴加AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR抗体，4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育20 min，DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染3 min，盐酸乙醇分化，自来水冲洗，脱水，透明，封片，镜检，采用Image-Pro Plus 6.0测定每个视野中积分光密度(IOD)值，并进行统计分析。采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测肝组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表达水平。取肝组织，称定质量，加入含有质量分数10 g/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，匀浆后，4 ℃，离心半径10 cm，3 000 r/min离心15 min，上清液采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。加上样缓冲液和RIPA制备样品，上样量100 μg蛋白，经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗[AMPK(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、LKB1(1∶1 000)、HMGCR(1∶1 000)兔抗单克隆抗体、β-actin兔抗单克隆抗体(1∶3 000)]过夜、洗涤；加入二抗[辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(1∶10 000)]，室温孵育1 h，ECL显影并扫描。运用Image J软件测定蛋白条带灰度值，通过计算目的条带与内参的灰度值比值来分析AMPK、p-AMPK、LKB1及HMGCR相对表达水平。

1.4.4 肝组织中AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平

采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测。根据GenBank数据库(登录号NM023991、NM001108069.1、NM013134.2、NM017008.4)的AMPK、LKB1、HMGCR基因序列设计特异性引物，引物序列见表1。制备肝脏匀浆，用TriQuick试剂充分研磨匀浆后提取总RNA，检测RNA浓度及纯度。在20 μL反应体系内合成cDNA，以2 μL cDNA为模板，加入靶基因上下游引物于15 μL反应体系内进行PCR扩增。

表1 Real-time PCR引物序列

反应结束后，根据扩增曲线及溶解曲线判断PCR反应特异性。所得结果以GAPDH为内参，用2-△△CT法计算目的基因相对水平。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平对比

与正常组对比，模型组大鼠血清中TG、TC、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比，4个给药组TG、TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与辛伐他汀组对比，柴胡皂苷3个剂量组TG、TC水平升高(P<0.05)，低、中剂量组LDL-C水平升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)。与柴胡皂苷低剂量组对比，中、高剂量组TG、TC、LDL-C水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平对比

2.2 各组大鼠肝脏组织病理学形态对比

正常组大鼠肝细胞形状规则，呈索状分布，细胞边界清晰，未见脂肪滴；模型组大鼠肝细胞形态不规则，边界模糊，细胞肿胀且大小不一致，胞浆内可见大量脂肪滴(箭头所示)；辛伐他汀组和柴胡皂苷低、中、高剂量组大鼠肝细胞浆存在少量脂肪滴，肝组织病理学形态明显改善。见图1。

2.3 各组大鼠肝脏组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白水平对比

与正常组对比，模型组大鼠肝脏中有少量AMPK、p-AMPK、LKB1沉积，IOD值显著减小(P<0.05)；有大量HMGCR沉积，IOD值显著增加(P<0.05)。与模型组对比，4个给药组大鼠肝脏中有大量AMPK、p-AMPK、LKB1沉积，IOD值显著增加(P<0.05)；有少量HMGCR沉积，IOD值显著减小(P<0.05)。与辛伐他汀组对比，柴胡皂苷低、中剂量组大鼠肝脏中少量AMPK沉积、IOD值显著减小(P<0.05)，而柴胡皂苷高剂量组有大量AMPK沉积，IOD值显著增加(P<0.05)；柴胡皂苷低、中、高剂量组有少量p-AMPK沉积、IOD值显著减小(P<0.05)，有大量HMGCR沉积、IOD值显著增加(P<0.05)；柴胡皂苷低剂量组有少量LKB1沉积、IOD值显著减小(P<0.05)，柴胡皂苷中、高剂量组有大量LKB1沉积、IOD值显著增加(P<0.05)。见图2、表3。

表3 各组大鼠肝脏组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的IOD值对比

Western blotting结果显示：与正常组对比，模型组大鼠肝组织AMPK、p-AMPK、LKB1水平降低，灰度值减小，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比，4个给药组大鼠肝组织AMPK、p-AMPK、LKB1水平升高，灰度值增加(P<0.05)；HMGCR水平降低，灰度值减小(P<0.05)。与辛伐他汀组对比，柴胡皂苷3个剂量组大鼠肝组织AMPK水平显著降低，灰度值显著减小(P<0.05)；柴胡皂苷高剂量组大鼠肝组织LKB1水平显著降低，灰度值显著减小(P<0.05)；柴胡皂苷低、中、高剂量组大鼠肝组织HMGCR水平显著升高，灰度值显著增加(P<0.05)。与柴胡皂苷低剂量组对比，柴胡皂苷中、高剂量组AMPK水平显著升高，灰度值显著增加(P<0.05)；柴胡皂苷高剂量组大鼠肝组织LKB1水平显著降低，灰度值显著减小(P<0.05)；柴胡皂苷中剂量组大鼠肝组织HMGCR水平显著升高，灰度值显著增加(P<0.05)；柴胡皂苷高剂量组大鼠肝组织HMGCR水平显著降低，灰度值显著减小(P<0.05)。见图3、表4。

表4 各组大鼠肝脏组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的灰度值测定结果

2.4 各组大鼠肝脏组织中AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平对比

与正常组对比，模型组大鼠肝组织AMPK、LKB1 mRNA水平降低，HMGCR mRNA水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比，4个给药组大鼠肝组织AMPK、LKB1 mRNA水平升高，HMGCR mRNA水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与辛伐他汀组对比，柴胡皂苷3个剂量组大鼠肝组织AMPK、LKB1 mRNA降低(P<0.05)，柴胡皂苷低、中剂量组大鼠肝组织HMGCR mRNA水平升高(P<0.05)。与柴胡皂苷低剂量组对比，柴胡皂苷中、高剂量组大鼠肝组织AMPK、LKB1 mRNA水平显著升高(P<0.05)，HMGCR mRNA水平显著降低(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠肝脏组织中AMPK、LKB1、HMGCR mRNA水平对比

3 讨 论

高脂血症是由于脂肪代谢或功能异常导致血液中脂质或脂蛋白水平异常升高的一种疾病，常因饮食失调、肥胖、家族性高胆固醇血症等遗传疾病或糖尿病等其他疾病引起[14]。高脂血症以TC、TG、LDL-C升高和HDL-C降低为主要特征，其中TC是急性缺血性卒中患者卒中严重程度和预后不良的重要独立预测因子。研究发现，中风患者的性别和血清TC、LDL-C和HDL-C水平之间存在显著关联，尤其是TC指标的变化与中风的严重程度密切相关[15-16]。目前研究还关注LDL-C与心血管疾病发生的关系，LDL-C包括乳糜微粒、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白及其残余物等富含甘油三酯的脂蛋白。降低LDL-C可进一步减少心肌梗死、脑血管事件的发生，故本研究采用SD大鼠进行模型制备高脂血症模型大鼠。结果发现，与模型对照组对比，柴胡皂苷A低、中、高剂量组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平均显著降低，HDL-C水平显著升高。可见，柴胡皂苷A可较好地降低血脂指标。

高脂血症的发生与脂代谢紊乱密切相关，而LKB1/AMPK信号通路已经被证实与脂代谢相关。AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[17]，也是一种细胞能量传感器，能参与机体的能量代谢调节过程，并在包括脂质代谢在内的多种代谢异常疾病中发挥着重要作用[18]。AMPK能通过上游LKB1在AMPKα亚基的Thr172处磷酸化而被激活[19]。在胆固醇的生物过程中，肝脏作为其主要器官，而HMGCR作为催化3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羟戊酸的限速酶，其活性降低可以减少胆固醇的合成[20]。可见，激活AMPK蛋白可减少脂肪生成、增加脂肪酸氧化，以调节肝脏脂质代谢。鉴于此，本研究采用免疫组化和蛋白质印迹法，观察柴胡皂苷A对LKB1/AMPK通路相关蛋白的表达变化。结果发现，与正常组对比，模型组大鼠肝组织AMPK、p-AMPK、LKB1蛋白水平显著降低，说明高脂血症大鼠与LKB1/AMPK信号通路相关；与模型组对比，柴胡皂苷A各剂量组大鼠肝组织AMPK、p-AMPK、LKB1水平显著升高，HMGCR水平显著降低；柴胡皂苷A各剂量组对比，柴胡皂苷A高剂量组大鼠肝组织LKB1水平升高最明显，HMGCR水平降低最显著。最后，为了验证结果的一致性，还对AMPK、LKB1、HMGCR mRNA进行检测，结果发现mRNA与蛋白的表达趋势一致，进一步验证柴胡皂苷A能通过LKB1/AMPK通路降低高脂血症大鼠的血脂的分子机制。

此外，本研究还在形态学上观察柴胡皂苷A的治疗效果，采用HE染色的方法观察各组高脂血症大鼠肝脏的病理变化，结果发现，正常组大鼠肝细胞形状规则，呈索状分布，细胞边界清晰，未见脂肪滴；而模型组大鼠肝细胞形态不规则，边界模糊，细胞肿胀且大小不一致，胞浆内可见大量脂肪滴；柴胡皂苷A各剂量组大鼠肝细胞浆虽存在少量脂肪滴，但有显著改善。

综上所述，柴胡皂苷A能改善高脂血症大鼠的血脂水平，其作用机制是通过降低HMGCR蛋白和促进LKB1/AMPK信号通路表达，而达到降血脂的作用。