固本防哮饮对哮喘合并食物过敏小鼠NLRP3炎症小体通路的影响

候淑婷，陆远，赵霞*，邢琼琼，严花，尤焱南

(1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学中医儿科研究所 江苏省儿童呼吸疾病中医药重点实验室，江苏 南京 210023；3.苏州大学附属儿童医院，江苏 苏州 215000)

哮喘是以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病，若儿童时期迁延失治可延及成人时期[1]。引起哮喘反复发作的诱因繁杂，而食物过敏是儿童最常见的诱因之一[2]，如果诊治不及时，随着过敏原的反复刺激，可加重加快哮喘气道不可逆性缩窄和气道重塑病程的发展。因此，针对食物过敏原诱发的哮喘，早期干预治疗对提高疗效具有重要意义。《医旨绪余·哮》曰：“有饮食厚味伤脾，不能运化而发者”。脾伤则津液不得布散而生痰涎，壅塞经隧，肺气为之不利。故中医在哮喘的治疗中强调“益气固表，培土生金”。固本防哮饮是儿科专家江育仁教授治疗哮喘缓解期的经验方，具有补肺固表，健脾化痰之功效。随机对照临床试验证实固本防哮饮治疗缓解期哮喘儿童安全、有效[3]。

研究表明NLRP3炎症小体介导的IL-1β是诱发炎症并导致哮喘的关键因素之一，食物诱发的过敏反应和药物诱导的哮喘均与NLRP3基因多态性存在关联[4]。哮喘儿童在摄入致敏性食物后，食物抗原被胃肠道吸收，与胃肠道淋巴结产生炎症反应，并经淋巴或血液循环而对肺部造成影响，进而诱发呼吸道的症状[5]。肠道、呼吸道炎症疾病发生发展与NLRP3炎症小体通路都有密切联系[6-7]，在这些疾病进展中皆存在NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达升高[8]。此外有研究表明,在严重和类固醇抵抗类型的哮喘中的气道炎症发生皆与NLRP3、IL-1β表达水平相关[9]，而抑制NLRP3 /IL-1β信号传导途径可以降低相关促炎因子的产生，改善肺部通气功能[9-10]。在炎症反应相关通路上，NLRP3炎症小体通路作为关键环节，其释放促炎细胞因子可导致上皮屏障的渗透性增强，而气道上皮屏障功能的受损与哮喘发作和进行性加重程度密切相关[11]，这提示NLRP3可能是防治哮喘合并食物过敏气道炎症的重要靶标。课题组前期研究在RSV-OVA联合造模小鼠中也显示哮喘气道上皮屏障完整性受损，表现为较高的上皮通透性，炎性细胞因子分泌增加[12]，而固本防哮饮可以减少B细胞活化和IgE的释放[13]。基于此，本研究通过建立哮喘合并食物过敏的小鼠模型，探讨固本防哮饮对哮喘合并食物过敏小鼠的气道上皮屏障保护和NLRP3炎症小体通路作用的潜在机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雌性BALB/c小鼠，3～5周龄，体质量18～20 g ，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2019-0010。

1.2 主要试剂与仪器

孟鲁司特钠颗粒剂(4 mg/袋，产品批号：0001050050，杭州默沙东药业股份有限公司)；卵蛋白(OVA，批号：326A058，美国 Sigma 公司)；BCA蛋白定量试剂盒(批号：23227，美国Thermo Scientific公司)；DEPC水 (批号：R0021)；RIPA裂解液 (批号：P0013B)；PowerPac Basic电泳槽、Chemi- Doc化学发光成像仪：美国 Bio-Rad 公司；美国M200 PRO酶标仪；兔抗NF-κB小鼠多克隆抗体(货号：ab7970) 与山羊抗兔多克隆二抗 (货号：ab6721) 来源于美国Abcam公司；兔抗IL-1β小鼠多克隆抗体(货号：12242S) 与兔抗NLRP3小鼠多克隆抗体(货号：15101S)来源于Cell Signaling Technology公司；兔抗caspase-1小鼠多克隆抗体(货号：22915-1-AP) 与山羊抗鼠多克隆二抗 (货号：SA00001-1)来源于Proteintech公司；兔抗GAPDH小鼠多克隆抗体(货号：100494-1-AP)、兔抗claudin-1小鼠多克隆抗体 (货号：13050-1-AP) 、兔抗E-cadherin小鼠多克隆抗体 (货号：20874-1-AP)、兔抗occludin小鼠多克隆抗体 (货号：27260-1-AP)均来源于Proteintech公司；山羊抗兔多克隆二抗 (货号：ab6721)来源于美国Abcam公司。

1.3 药物制备

固本防哮饮饮片购于江苏省中医院，黄芪、党参、白术、茯苓、煅牡蛎、蝉蜕、陈皮、防风、辛夷、五味子、甘草按照配伍比例为5∶3.33∶3.33∶3.33∶5∶2∶2∶1∶2∶2∶1组成。先将煅牡蛎煮30 min，其余药材用蒸馏水室温浸泡30 min，然后将所有药材混合，分别用8和6倍(v/w)蒸馏水煮沸2次，每次30 min，最后将获得的上清液混匀，在负压下65 ℃，浓缩至3 g/mL，4 ℃保存备用。质量控制按前期研究的方法进行[14]。

1.4 动物造模、分组及给药

实验小鼠，适应性饲养1周后，除正常组外的小鼠分别在第1、14天给予腹腔注射0.2 mL致敏液(OVA 100 μg，氢氧化铝凝胶1 mg，溶解于0.9%的氯化钠溶液中)，正常组以0.2 mL 0.9%的氯化钠溶液腹腔注射。第28天用0.25 mL 灌胃液(OVA 50 mg，溶解于0.9%的氯化钠溶液中)进行食物过敏原激发，每2 d 1次，共6次。然后在第40、45、50天，以 50 μL OVA(1 mg/mL，溶解于0.9%的氯化钠溶液中)进行气道激发。正常组以同体积0.9%的氯化钠溶液代替灌胃或滴鼻。腹腔致敏后11 d(第25天)，将造模小鼠分为正常组(control)、单纯气道模型组(AR)、联合模型组(FAR)、联合模型组+固本防哮饮组(GBFXD)(给予联合模型组固本防哮饮24 g生药/kg)、联合模型组+孟鲁司特钠组(Mont)(给予孟鲁司特钠颗粒剂2.6 mg/kg)干预，每日灌胃给药1次，共28 d，两种模型组、正常组小鼠给予20 mL/kg 0.9%的氯化钠溶液灌胃。给药剂量参照陈奇《中药药理研究方法学》，末次给药24 h后，处死，取相应组织-80 ℃存储备用。

1.5 肺病理染色

小鼠右肺中叶用4%多聚甲醛溶液4 ℃固定过夜，常规石蜡包埋切片(厚度约为5 μm)，进行HE染色。在倒置显微镜下观察HE染色中炎性细胞浸润情况，进行病理组织评分。炎症评分为：0级，无炎症；1级，偶见炎症细胞；2级，支气管或血管周围的1～2层炎症细胞；3和4级分别代表3～5层细胞中层，或5层以上的炎症细胞。

1.6 免疫荧光检测

石蜡切片经脱蜡后进行抗原修复，用PBST洗涤3次，每次5 min。以5%山羊血清室温封闭60 min，加入一抗claudin-1(1∶300)，4 ℃过夜。用PBS洗涤3次，每次5 min，加入二抗Alexa fluor 488，室温避光孵育1 h，PBS洗涤3次。Dapi复染后PBS洗涤，荧光显微镜下观察。将一抗更换为occludin(1∶200)、E-cadherin(1∶300)分别进行免疫荧光检测。

1.7 NLRP3/IL-1β信号通路中关键蛋白的检测

将组织蛋白裂解液加入各组小鼠的肺组织中，使用球磨仪进行充分研磨，然后放置冰上30 min后，4 ℃ 13 000 r/min离心取上清液，BCA法测定蛋白浓度，将上样蛋白浓度定为2 μg/μL，煮沸5 min进行蛋白变性;分别配制分离胶和积层胶，按照S1 80V 30 min、S2 110V 60 min进行电泳；电泳后进行转膜，转膜后用3%BSA封闭，置摇床上2 h后，用1×TBST洗膜3次，分别加入按1∶600、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶10 000比例稀释的NF-κB、NLRP3、IL-1β、caspase-1、β-actin一抗，4 ℃过夜；1×TBST洗膜3次，常温下用1∶10 000稀释的二抗于摇床上孵育2 h，1×TBST洗膜3次，5 min/次，然后进行条带曝光。用Image J软件处理各条带，以目的蛋白与β-actin的灰度比值作为目的蛋白的相对含量。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 固本防哮饮对哮喘小鼠的肺部炎症的影响

与control组相比，AR和FAR组支气管和血管周围见炎症细胞浸润(P<0.05)，且FAR较AR组见明显气道炎症(P<0.05)，而GBFXD治疗可抑制其炎症细胞浸润(P<0.01)，见图1。病理评分结果见图2。

图1 小鼠肺组织HE染色(×200)

注：与control组相比，**P<0.01；与AR组相比，△P<0.05;与FAR组相比，##P<0.01。

2.2 固本防哮饮对哮喘小鼠的肺部连接蛋白的影响

与control组相比，AR和FAR组小鼠肺组织中的claudin-1无显著变化(P>0.05)，而occludin、E-cadherin的表达水平显著降低(P<0.05)，与FAR相比，GBFXD小鼠肺组织中的occludin、E-cadherin显著上调(P<0.05)，见图3。

注：与control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与FAR组相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.3 固本防哮饮对NLRP3/IL-1β信号通路中相关蛋白的调控

与control组相比，AR和FAR组小鼠肺组织中的caspase-1、NLRP3、NF-κB、IL-1β的表达水平显著升高(P<0.05)，与FAR组相比，GBFXD小鼠的肺组织中的caspase-1、NLRP3、NF-κB、IL-1β显著降低(P<0.05)，见图4。

注：与control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与FAR组相比，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

NLRP3是NOD样受体(NLRs)家族中研究最广泛的一个成员，NLRP3炎性小体的多蛋白复合物由传感器-NLRP3，包含半胱天冬酶募集结构域(ASC)、效应蛋白-半胱天冬酶-1(caspase-1)和适配子-凋亡相关的斑点样蛋白组成，广泛存在于上皮细胞和免疫细胞中[15]。作为NLRP3炎性小体的核心蛋白，NLRP3蛋白的C端保守的LRRs域可以调节NLRP3活性，并检测内源性警报蛋白和微生物配体；N末端吡啶结构域(PYD)可以解释与衔接子蛋白ASC的同型相互作用。在ASC包含两个转导结构域，一个是可连接上游NLRP3的吡啶结构域，另一个是可连接下游caspase-1的半胱天冬酶募集结构域(CARD)caspase-1作为NLRP3炎性体的效应蛋白，可以将pro-IL-1β和pro-IL-18转化为它们的活性形式IL-1β和IL-18[16]，而释放到胞外的IL-1β能诱导上皮紧密连接(TJ)通透性增加,在炎症疾病的发生和发展中具有重要作用。研究表明在肠道炎症中，IL-1β诱导的肠上皮紧密连接通透性的增加是由NF-κB通路的MEKK-1激活介导，NLRP3炎性小体可以诱导有效的炎症反应，氧化应激和促炎细胞死亡，炎症和氧化应激可诱导内皮损伤，激活NF-κB信号通路，NF-κB信号通路的激活增加了促炎性介质(如细胞因子和趋化因子)的分泌，介导白细胞的粘附并促进白细胞的外渗等反应，进而导致肌动蛋白结合蛋白磷酸化，肌动蛋白应激纤维形成，细胞骨架重塑和内皮收缩，所有这些反应改变了细胞的收缩力和破坏细胞间的连接增加内皮的通透性[17]。

哮喘和食物过敏之间联系紧密，两者间具体的相互作用和潜在机制尚不清楚，但这两种异质性疾病的发病率近几年来显著增加。在儿童人群中观察到的变异报告显示[18]，约3.5%～8%的儿童有食物过敏，约14%的儿童有哮喘症状。有报告显示，48%的哮喘患者有食物过敏，约有一半的食物过敏儿童有呼吸道过敏症状；哮喘患者与非哮喘患者比较，45%的哮喘患者存在食物过敏。另一方面，哮喘患者往往会出现多种严重的食物过敏，食物过敏常与哮喘控制不良有关。哮喘和食物过敏的共存，具有显著的临床相关性,增加危及生命的哮喘发作的风险，以及食物过敏原触发哮喘发作或食物过敏，故及时防治在疾病的进展中具有重要意义。

固本防哮饮是江育仁教授在二陈汤和玉屏风散基础上加减而成。方中黄芪、党参、防风、白术益气固表；陈皮、茯苓、甘草健脾益气；煅牡蛎固涩补肾、蝉蜕祛风、辛夷宣窍敛肺、五味子补气敛肺，全方扶正与驱邪并施，攘外与安内并行，在健脾益肺、补肺固表同时，也补肾纳气。中医药治疗疾病讲究整体观念，重视疾病之间的联系作用。明代儿科医家万全在《万氏家藏育婴秘诀·五脏证治总论》中指出小儿的体质特点为：“五脏之中脾常不足肾常虚……娇肺遭伤不易愈”[19]。哮喘的发病是由于体内的“伏痰”在外来因素的诱导导致的气因痰阻，痰阻气结而发病。《医学入门·卷之四》曰：“痰原于肾, 动于脾, 客于肺，水火升降，脾胃调和，痰从何生”[20]。故在治疗中强调肺脾肾的重要性。食物导致的过敏是哮喘发生的外因，哮喘引起患者自身的免疫反应是其反复发作的内因。内在可控，外因难防，故早期保护屏障的完整，减少外来病原体的入侵，降低炎症风暴效应，在哮喘的治疗中有显著作用。

由于卵清蛋白是引起食物过敏的主要物质，在本此实验研究中，采用OVA诱导单纯呼吸道和哮喘合并食物过敏混合小鼠模型。研究中，我们观察到混合模型小鼠的气道炎症显著增加，而固本防哮饮可以上调在联合模型中的屏障连接蛋白occludin、E-cadherin表达，保护气道屏障的完整，抑制NLRP3炎症小体通路及下游NF-κB炎症信号的激活，减低食物过敏加重的哮喘气道炎症。这进一步为固本防哮饮治疗儿童哮喘提供了理论基础，也为中医药多靶点、多途径理论研究提供科学依据。近几年越来越多证据显示临床控制哮喘发作药物，在安全性方面有较大争议。其中孟鲁司特钠在2020年被美国食品药品监督管理局(FDA)发布黑框警告：其可诱发严重神经精神不良事件，建议限制使用。而中医药在治疗哮喘方面具有独特的优势，且相对安全有效，其治疗机制值得进一步深入研究。