刺五加对大鼠睡眠-觉醒节律的影响及脑内GABA、L-Glu含量变化的研究

张正一，李廷利，王艳艳，于爽，黄莉莉，杨帆，卞宏生

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

人类的睡眠-觉醒行为是千百年来与昼夜节律相适应而形成的一种稳定的行为特征，是人类生命活动的重要内容，与人的生命健康息息相关。但据世界卫生组织调查表明，全球27%的人都存在睡眠问题。研究发现，当今由于人们的生活方式发生了重大改变，诸多因素如因熬夜学习、工作、上网等人为延长光照时间[1]，饮食无规律[2]等破坏了昼夜节律，进而影响了机体的睡眠-觉醒节律。其中，人为地延长光照时间是造成睡眠-觉醒节律变化的重要原因，导致失眠，威胁人们的生命健康[3]。而现代研究表明，脑内谷氨酸(Glu)，γ-氨基丁酸(GABA)是睡眠调节中不可或缺的重要因素[4]，亦是研究睡眠机制的重要切入点之一。

刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根和根茎或茎[5]。早在南北朝时期，《炮炙论》中对刺五加就有“阳人使阴，阴人使阳”的记载[6]。现代研究发现刺五加对睡眠节律有调节作用，在治疗失眠、神经衰弱等方面有显著疗效。研究发现刺五加中有多种成分均具有使患者提前入睡、增加睡眠时间和深度的功效[7]。课题组也发现刺五加对睡眠节律有调节作用，可减少24 h持续黑暗环境下果蝇的片段化睡眠[8]。

基于此，本文在前期研究的基础上，利用实验动物监测系统，以SD雄性大鼠为研究对象，探讨刺五加对大鼠睡眠-觉醒节律的影响及脑内GABA、L-Glu含量的变化。

1 材料

1.1 仪器

实验动物监测系统：型号CLAMS，美国COLUMBUS公司(注：该系统由活动评价模块和睡眠探测分析模块两部分组成，构成系统的睡眠高通量筛选功能)；多功能酶标仪：型号SynergyMx,美国伯腾仪器有限公司；分析天平：型号MS204S，美国梅特勒一托力多仪器上海有限公司；高速低温冷冻离心机：型号3-18R(3006004)，美国TOMOS有限公司。

1.2 药品与试剂

刺五加浸膏(刺五加苷B含量为0.546%，刺五加苷E含量为0.328%,由黑龙江中医药大学中药药理教研室提供)，临用时以生理盐水配制成24.3 mg/mL的溶液；戊巴比妥钠，国药集团化学试剂有限公司，批号WS20060401，临用时以生理盐水配制成0.5 mg/mL溶液；GABA ELISA Kit，R&D Systems Inc，Lot 20180501A；L-Glu ELISA Kit，R&D Systems Inc，Lot 20180501A。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，体质量(300±50)g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。实验环境为屏蔽、隔音、避光、通风状态，采用自动定时光控系统对大鼠的生活环境实行12 h/12 h明暗交替的光照周期处理(即7∶00—19∶00光照；19∶00—次日7∶00黑暗)，光照强度：300 lux，湿度：40 %～70 %，室温：(24±3) ℃，噪声≤40 dB。

2 方法

2.1 刺五加对持续光照条件下大鼠睡眠-觉醒节律的干预研究

将大鼠在实验环境下饲养1周，适应环境，期间自由饮水和获取食物。1周后取大鼠18只，随机分为正常光照组(LD组)、持续光照组(LL组)、给药组(LLG组)，每组6只。分别将LD组、LL组大鼠放于CLAMS系统内，设定采集率为1samples/30 s，即系统每30 s自动收集1次样本数据。以活动次数count=0，活动阈值epochs=30 s下，单笼饲养，在正常光照和持续光照条件下，于19∶00—20∶00定时给予与LLG组等剂量的生理盐水，连续7 d，记录大鼠的睡眠-觉醒节律以及睡眠时间。将LLG组大鼠放于CLAMS系统内，设定同上，进行连续7 d的持续光照后，于19∶00—20∶00定时给予60.75 mg/kg刺五加溶液，连续7 d，记录大鼠的睡眠-觉醒节律以及睡眠时间。

2.2 刺五加对持续光照条件下大鼠脑内GABA、L-Glu的含量变化研究

将大鼠在实验环境下饲养1周，适应环境，期间自由饮水和获取食物。1周后取SD大鼠30只，随机分为正常光照白天组、正常光照夜晚组、持续光照白天组和持续光照夜晚组，给药白天组，给药夜晚组，每组6只。将6组大鼠按照上述方法进行实验，于给药的最后1日11∶00和23∶00，分别戊巴比妥钠腹腔注射使大鼠麻醉(40 mg/kg)后断头取脑，在分析天平中精密称重后，加入9倍量的生理盐水在冰浴中匀浆，将匀浆液离心，3 000 r/min离心10 min，分离上层血清，置于低温冰箱中保存。根据试剂盒说明书操作，数据记录在Excel工作表中，以标准品的浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制出标准线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。(注：11∶00和23∶00的时间选取由睡眠-觉醒节律图以及睡眠时间中具有显著性差异的时间段所决定)

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 刺五加对持续光照条件下大鼠睡眠-觉醒节律的干预研究

3.1.1 刺五加对持续光照条件下大鼠睡眠-觉醒节律的研究

正常光照组大鼠的睡眠-觉醒呈现昼夜节律变化，节律周期稳定。表现为大鼠白天的休息间隔较多处于睡眠状态，夜晚的活动间隔较多处于觉醒状态，且睡眠呈现片段化。与正常光照组比较，持续光照组大鼠的睡眠-觉醒节律的节律相位后置，昼夜节律特征退化，节律周期改变。在最初的1 d内大鼠的节律仍保持为作为夜行动物的基本节律，随着时间的延长，节律相位后置日趋明显，从第2 天起大鼠的昼夜节律明显发生改变，表现为大鼠9∶00—11∶00较多处于觉醒状态，19∶00—23∶00较多处于睡眠状态，且睡眠呈现片段化。这种现象以第7天最明显，详见图1。

注：A.LD组；B.LL组；C.LLG组。箭头显示第7天结果。

3.1.2 刺五加对持续光照条件下大鼠睡眠时间的研究

结果显示,与正常光照组比较，第7天，9∶00—11∶00持续光照组睡眠时间减少，差异有统计学意义(P<0.05)。19∶00—21∶00、19∶00—21∶00、21∶00—23∶00、23∶00—1∶00及5∶00—7∶00持续光照组睡眠时间均增多，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与持续光照组比较，第7天，9∶00—11∶00给药组睡眠时间增多，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 各时间段刺五加对持续光照条件下大鼠睡眠时间的影响

3.2 刺五加对持续光照条件下大鼠脑内GABA、L-Glu的含量变化研究

实验结果表明，在11∶00时，与正常光照组比较，持续光照组GABA含量下降，L-Glu含量升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与持续光照组比较，给药组GABA含量升高(P<0.05)。在23∶00时，与正常光照组比较，持续光照组GABA含量升高，L-Glu含量下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与持续光照组比较，给药组GABA含量下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 刺五加对持续光照条件导致大鼠脑内GABA、L-Glu含量变化的干预作用

4 讨论

随着社会的发展和进步，诸如跨时区交流、加班倒班、手机上网等工作或娱乐活动日趋普遍，人们面临的睡眠问题也逐渐发生变化[9]。通过对中国知网近10年的检索报告进行分析发现,以“睡眠”和“节律”为主题的相关研究报告呈现大幅度上升趋势，其中节律紊乱性睡眠障碍正在成为威胁现代人身心健康的重要问题，引起学者的高度关注[10-11]。

针对这种节律紊乱导致的失眠问题，中医药有其独特的认识。《本草纲目》记载刺五加具有“补中益气，强筋骨意志，久服轻身耐老”的功效。2020年版《中国药典》也指出其“益气健脾，补肾安神”的作用。现代研究发现，刺五加具有改善心脑血液循环、调节中枢神经和内分泌系统的功能，对习惯性失眠、神经衰弱和食欲不振有显著疗效[12-13]。目前，刺五加已成为一种“适应原”样药物和保健食材被很多国家广泛使用，且基本无不良反应报道[14]。

现有文献报道，L-Glu与GABA是脑内最重要的兴奋性和抑制性神经递质，对大脑皮层、丘脑、海马神经元有很强的兴奋作用，而脑内的L-Glu与GABA代谢主要通过L-Glu/GABA-Gln代谢环路进行循环。研究发现L-Glu/GABA-Gln的兴奋/抑制功能失衡与睡眠-觉醒节律密切相关[7-9]，L-Glu/GABA-Gln代谢环路是脑内L-Glu和GABA代谢转换的主要途径[10]，因此考虑睡眠-觉醒节律改变是否与L-Glu/GABA-Gln代谢环路的失衡相关。

本研究利用实验动物监测系统CLAMS和酶联免疫测定技术，以睡眠-觉醒节律和睡眠时间以及脑内GABA、L-Glu等睡眠促进物质为指标，研究刺五加改善持续光照条件下大鼠睡眠-觉醒节律的作用及其脑内GABA、L-Glu的含量变化研究。

目前分析睡眠-觉醒状态的常用方法有3种，分别是皮层脑电图(EEG)、视频数字分析方法，以及利用CLAMS红外光束IR的高通量筛选方法，本文利用CLAMS记录大鼠睡眠-觉醒节律，优势在于在不损伤动物的前提下，可以长时间进行记录大鼠的活动状态，从而绘制睡眠-觉醒节律图。

在刺五加对持续光照条件下大鼠睡眠-觉醒节律的干预研究中发现,刺五加可以通过调整大鼠的睡眠-觉醒节律分布，使处于持续光照条件下大鼠的睡眠-觉醒节律紊乱现象得到恢复，与正常光照组相比，持续光照条件下的大鼠，在9∶00—11∶00多处于觉醒状态，21∶00—23∶00多处于睡眠状态的睡眠-觉醒行为表现，经过刺五加给药后又恢复到与正常光照组相近的节律分布，可以看出在9∶00—11∶00多处于睡眠状态，21∶00—23∶00多处于觉醒状态，这种现象以11∶00和23∶00前后最为突出。且通过对睡眠觉醒节律图以及睡眠时间的研究，我们可以发现，无论是将持续光照组大鼠与正常光照组大鼠相比较，还是将给药组大鼠与持续光照组大鼠相比较，11∶00和23∶00这两个时间段，差异都具有统计学意义(P<0.05)。基于此，在大鼠脑内GABA、L-Glu含量研究中，选定11∶00和23∶00这两个时间段，进行大鼠断头取脑的操作，利用酶联免疫测定技术，测定脑内GABA、L-Glu的含量，结果发现,在11∶00时，与正常光照组比较，持续光照组GABA含量下降，L-Glu含量升高；与持续光照组比较，给药组GABA含量升高，具有显著性差异(P<0.05)。在23∶00时，与正常光照组比较，持续光照组GABA含量升高，L-Glu含量下降；与持续光照组比较，给药组GABA含量下降，具有显著性差异(P<0.05)。

本研究从较为直观的角度，即睡眠-觉醒节律图和睡眠时间，展现了刺五加可以改善大鼠的睡眠-觉醒节律；并通过L-Glu和GABA含量的变化，探讨了刺五加能通过调节大鼠的节律分布来改善大鼠的睡眠，其作用机制可能是通过影响L-Glu、GABA的含量变化而改善大鼠的睡眠-觉醒节律。本研究从睡眠-觉醒节律角度揭示了刺五加改善睡眠的机制，同时为其他相关中药及制剂改善睡眠的研究提供了参考。