miR-489-3p靶向PTEN/PI3K/Akt信号通路对膀胱癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

王哲，张敬，吴仁通，张潮，陈怀安，苗文隆

膀胱癌(bladder cancer，BC)是我国常见的泌尿系统恶性肿瘤，男性发病率是女性的3～4倍，大部分患者只能通过药物治疗来缓解病情[1-2]。因此，明确BC的发展机制、寻找有效的分子靶点和诊断标志物是BC临床治疗的关键。微小RNA(miR)-489-3p已被证实参与调控BC等肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡[3-4]。在冠心病内皮细胞中，抑制miR-26a-5p表达可靶向第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)正调控磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路促进其细胞凋亡[5]。然而，miR-489-3p是否通过调控PTEN影响BC的增殖、凋亡、侵袭仍不清楚。因此，本研究将通过癌症基因组图谱(TCGA-BLCA)数据库分析BC中差异表达的miRNA，并探讨miR-489-3p与BC临床病理特征的关系及其在BC细胞中的功能和潜在的分子机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 组织和细胞来源 收集2018年6月—2021年7月河北北方学院附属第一医院泌尿外科110例BC患者手术切取的癌组织及其癌旁组织，于-80℃冰箱冷冻保存，并收集BC患者的临床病理资料。本研究获得医院伦理委员会批准(K2021095)，患者及家属均知情同意并签署知情同意书，且术前均未进行放疗或化疗。人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1及人膀胱癌细胞系5637、J82、T24购自南京科佰生物科技有限公司。

1.2 试剂与仪器 (1)试药、试剂：RPMI1640培养基、胎牛血清，购自美国HyClone公司；胰蛋白酶、Trizol、Lipofectamine 2000转染试剂、噻唑蓝(MTT)试剂、Transwell小室，均购自美国Invitrogen公司；PTEN、PI3K、Akt抗体及相应二抗，购自美国CST公司；逆转录试剂盒，购自上海赛默飞公司；SYBR premix Ex Taq PCR试剂盒，购自北京智杰方远科技有限公司；Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒，购自上海翌圣生物科技有限公司；miR-489-3p模拟物(miR-489-3p mimics)、miR-489-3p抑制物(anti-miR-489-3p)和阴性对照miR-NC、PTEN过表达重组载体(pc-PTEN)和空载体pcDNA，购自上海吉玛制药技术有限公司。(2)仪器、设备：StepOneTMPCR仪购自美国Thermo Fisher公司，Herocell 180 CO2细胞培养箱购自上海润度生物科技有限公司，PowerPacTM电泳仪、GelDoc Go凝胶成像系统、iMark酶标仪购自美国Bio-Rad公司，DxFLEX流式细胞仪购自贝克曼库尔特国际贸易(上海)有限公司。

1.3 细胞培养及分组 2021年1—7月进行细胞实验。将人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1及人膀胱癌细胞系5637、J82、T24置于含有10%胎牛血清及青、链霉素混合液的RPMI1640培养基，在37℃、CO2含量为5%的细胞培养箱中培养。采用Lipofectamine 2000转染试剂将miR-NC、miR-489-3p mimics、miR-489-3p mimics+pcDNA、miR-489-3p mimics+pc-PTEN分别转染至生长状态较好的T24细胞中，并记为：miR-NC组、miR-489-3p mimics组、miR-489-3p mimics+pcDNA组和miR-489-3p mimics+pc-PTEN组，另取常规培养的T24细胞作为对照组。48 h后收集各组T24细胞用于后续实验。

1.4 差异miRNA的筛选 下载TCGA-BLCA miRNA测序数据，应用R软件(3.6.3版本)中DESeq2包进行差异分析，并使用ggplot2包绘制火山图，蓝色为低表达，红色为高表达，筛选参数：LogFC>1且P<0.05。

1.5 观测指标与方法

1.5.1 miR-489-3p和PTEN mRNA水平检测：采用Trizol法提取RNA，使用逆转录试剂盒将其逆转录成cDNA，然后根据SYBR premix Ex Taq PCR试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR反应。采用2-ΔΔCt方法计算miR-489-3p和PTEN mRNA的相对表达量，以U6或GAPDH作为内参基因。miR-489-3p引物序列：5’-GGGGTGACATCACATATAC-3’(正向)，5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’(反向)；U6引物序列：5’-CCTGCTTCGGCAGCACA-3’(正向)，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)；PTEN引物序列：5’-AAGACCATAACCCACCACAGC-3’(正向)，5’-ACCAGTTCGTCCCTTTCCAG-3’(反向)；GAPDH引物序列：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTT-3’(正向)，5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’(反向)。

1.5.2 T24细胞增殖检测：将转染后的各组T24细胞制备成细胞悬液，接种至96孔细胞板上，培养至24、48、72 h时，分别加入MTT试剂(浓度为5 g/L)20 μl，4 h后利用酶标仪检测450 nm处的光密度值(OD)。每组处理后的T24细胞(每孔1×103)置于10 cm培养皿中，培养2周，最后用1%结晶紫染色，计数细胞集落数(克隆数目)。

1.5.3 T24细胞侵袭检测：Transwell法检测细胞侵袭。将解冻后的基质胶与不含胎牛血清的RPMI1640培养基充分混合，然后平铺在Transwell小室的上室，待其凝固后加入细胞悬液200 μl，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基600 μl，2 h后擦去未侵袭的细胞，采用多聚甲醛和结晶紫进行固定和染色，20 min后在显微镜下随机选取5个视野进行拍照并计数。染色的细胞即为发生侵袭的细胞。

1.5.4 T24细胞凋亡检测：按照Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒说明对转染后的各组T24细胞进行处理，并使用流式细胞仪检测其细胞凋亡率。

1.5.5 T24细胞中PTEN、PI3K、Akt蛋白表达检测：采用Western-blot实验检测T24细胞中蛋白表达。提取转染后各组T24细胞的总蛋白，将定量后的蛋白样品进行电泳、转膜、封闭、洗膜，然后加入PTEN、PI3K、Akt抗体，4℃培养过夜，洗涤后加入相应二抗，培养1 h，使用ECL化学发光系统检测各组T24细胞的蛋白表达水平。

1.5.6 T24细胞的相对荧光素酶活性：将miR-489-3p mimics与miR-NC分别与构建好的WT-PTEN 3’UTR或MUT-PTEN 3’UTR载体质粒利用Lipofectamine 2000转染试剂转染至T24细胞中，共分成4组：miR-NC+WT-PTEN 3’UTR组、miR-489-3p mimics+WT-PTEN 3’UTR组、miR-NC+MUT-PTEN 3’UTR组和miR-489-3p mimics+MUT-PTEN 3’UTR组。培养48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定各组T24细胞的相对荧光素酶活性。为进一步验证miR-489-3p与PTEN的作用关系，利用Lipofectamine 2000转染试剂将miR-NC、miR-489-3p mimics、anti-miR-NC(抑制物阴性对照)、anti-miR-489-3p(抑制物)分别转染至T24细胞中，并记为miR-NC组、miR-489-3p mimics组、anti-miR-NC组、anti-miR-489-3p组，48 h后收集各组细胞按照1.5.5的方法检测PTEN蛋白的表达水平。

2 结 果

2.1 差异miRNA的筛选 通过火山图分析TGCA数据库中BC组织中差异miRNA，筛选到miR-489-3p在BC组织中显著下调，见图1。

图1 火山图分析BC组织中的差异miRNA

2.2 BC组织和细胞系中miR-489-3p和PTEN mRNA表达水平比较 与癌旁组织比较，BC癌组织中miR-489-3p相对表达量下降，PTEN mRNA相对表达量上升(P<0.01)；与SV-HUC-1细胞比较，5637、J82、T24细胞中miR-489-3p相对表达量降低，PTEN mRNA相对表达量升高(P<0.05)，见表1。其中，T24细胞中miR-489-3p相对表达量最低，PTEN mRNA相对表达量最高，故选择T24细胞进行转染实验。

表1 BC组织及细胞系中miR-489-3p和PTEN mRNA表达水平比较

2.3 miR-489-3p表达在BC患者不同临床病理特征中比较 根据miR-489-3p的相对表达量均值分为低表达组(≤0.36)70例和高表达组(>0.36)40例，miR-489-3p低表达组患者TNM分期T3～4、有淋巴结转移、肿瘤低分化比例高于高表达组(P<0.05)，而2组患者性别、年龄及远处转移比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同临床病理特征BC患者中miR-489-3p表达比较 [例(%)]

2.4 miR-489-3p和PTEN的靶向关系 生物信息学网站预测结果显示，miR-489-3p和PTEN 3’UTR有互补的结合位点，见图2。miR-489-3p mimics+WT-PTEN 3’UTR组相对荧光素酶活性低于miR-NC+WT-PTEN 3’UTR组(P<0.05)；而与miR-NC+MUT-PTEN 3’UTR组比较，miR-489-3p mimics+MUT-PTEN 3’UTR组相对荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。另外，miR-489-3p mimics组PTEN蛋白表达水平低于miR-NC组，anti-miR-489-3p组PTEN蛋白表达水平高于anti-miR-NC组(P<0.05)，见图3、表4。

图2 miR-489-3p和PTEN的结合位点

注：A.miR-NC组；B.miR-489-3p mimics组；C.anti-miR-NC组；D.anti-miR-489-3p组

2.5 各组T24细胞的增殖、侵袭、凋亡及PI3K、Akt蛋白表达比较 与对照组、miR-NC组比较，miR-489-3p mimics组PTEN蛋白表达水平降低，OD值(24 h、48 h、72 h)下降，克隆数目和细胞侵袭数减少，凋亡率和PI3K、Akt蛋白表达水平增高，差异均具有统计学意义(P<0.01)；与miR-489-3p mimics组、miR-489-3p mimics+pcDNA组比较，miR-489-3p mimics+pc-PTEN组PTEN蛋白表达水平升高，OD值(24 h、48 h、72 h)增加，克隆数目和细胞侵袭数增多，凋亡率和PI3K、Akt蛋白表达水平下降，差异均具有统计学意义(P<0.01)。见图4、图5、表5、表6。

表3 各组相对荧光素酶活性比较

表4 各组PTEN蛋白表达比较

图4 各组T24细胞侵袭(结晶紫染色，×200)、凋亡情况比较

注：A.对照组；B.miR-NC组；C.miR-489-3p mimics组；D.miR-489-3p mimics+pcDNA组；E.miR-489-3p mimics+pc-PTEN组

表5 各组T24细胞PTEN蛋白表达及各时点OD值、克隆数目比较

表6 各组T24细胞侵袭数、凋亡率及PI3K、Akt蛋白表达比较

3 讨 论

外科手术是治疗BC的主要方法，但由于其术后复发率高，患者的生存率仍然较低[6]。因此，探究新的靶向药物是BC临床治疗的重中之重。

国内外研究表明，miRNA与肿瘤细胞的生长、凋亡等联系密切，可作为肿瘤早期诊断或预后标志物[7-8]，也可通过与靶基因结合发挥抑癌或抗癌作用[9-11]。本研究首先通过火山图分析TGCA数据库BC组织中差异miRNA，进而筛选到显著下调的miR-489-3p。以往研究表明，miR-489-3p通过调控不同靶点抑制胰腺癌、胶质瘤、骨肉瘤细胞进展[12-14]，但是miR-489-3p在BC中的研究极少。本研究发现，miR-489-3p在BC组织和细胞系中的表达降低，与Li等[15]的研究结果一致。另外，本研究还发现，miR-489-3p低表达与BC患者的临床分级明显相关，说明miR-489-3p可能作为抑癌因子在BC中起作用。由于T24细胞中miR-489-3p相对表达量最低，因此选择T24细胞进行转染实验。

进一步研究发现，miR-489-3p过表达抑制了T24细胞增殖和侵袭并诱导了细胞凋亡，这与miR-489-3p在其他癌细胞中的作用一致，进一步揭示了miR-489-3p在BC中的抗癌功能。然而，miR-489-3p调控BC细胞生物学行为的分子机制还不清楚，需进行更深一步的研究。

本研究通过生物信息学网站预测得知PTEN是miR-489-3p的潜在靶基因，并证实了miR-489-3p靶向负调控PTEN表达。PTEN是10q23.3染色体上的一种抑癌基因，具有双重磷酸酶特性[16]。研究显示，PTEN参与癌细胞的生长、转移等过程[17-18]。本研究发现，PTEN在BC组织和细胞中上调，与Man等[19]的实验结果一致，提示PTEN在BC中发挥促癌作用。此外，本研究还表明同时过表达miR-489-3p和PTEN后促进了T24细胞增殖和侵袭，阻碍了细胞凋亡，揭示miR-489-3p靶向PTEN调控BC细胞的增殖、侵袭和凋亡。

最近的研究显示，PTEN能够通过调控PI3K/Akt通路蛋白表达影响肿瘤细胞的发生、发展[20]。在BC细胞中，PTEN的激活可抑制PI3K、Akt蛋白表达[21]。大量文献表明，PI3K/Akt通路参与调控BC在内的各种类型癌细胞的增殖、凋亡和侵袭，且PTEN与该通路呈负向调控的关系[21-24]。本研究也显示，miR-489-3p过表达可提高PI3K、Akt蛋白表达，而过表达PTEN能够逆转上述蛋白表达水平及miR-489-3p过表达对T24细胞增殖、侵袭的阻滞和对凋亡的增强作用。说明miR-489-3p通过靶向抑制PTEN表达，激活PI3K/Akt信号通路，调控BC细胞的增殖、凋亡和侵袭。

综上所述，miR-489-3p抑制BC细胞的增殖和侵袭、促进凋亡，其机制可能与靶向下调PTEN蛋白表达，激活PI3K/Akt信号通路有关。miR-489-3p可能作为分子标志物，为BC提供新的靶向治疗思路。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

王哲：研究构思，论文撰写；张敬：课题设计；吴仁通：数据获取；张潮：统计学分析；陈怀安：修改论文；苗文隆：论文终审