神经干细胞微囊泡抑制H2O2诱导DRG神经元氧化应激损伤机制研究

唐 彬 ，万长春，宗寿洋，胡嘉波

（1.金湖县人民医院，江苏金湖 211600；2.江苏大学医学院，江苏镇江 212013）

外周神经组织氧化应激的发生是周围神经病变的重要致病因素，氧化应激参与了神经损伤、毒性病变的发展过程。氧化应激过程中产生的大量氧自由基可导致神经元损伤, 包括DNA 损伤、胞内Ca2+释放、蛋白质破坏、脂质过氧化、营养因子丧失或异常等过程，通过调节细胞内信号并最终引起神经元凋亡或坏死[1]。研究表明[2-3]，氧化应激在神经元损伤中起到了关键作用。但在正常生理过程中，活性氧、活性氮等自由基能够促进神经元生存，维持其生理功能。因此，及时清除有害自由基及抑制细胞凋亡对于神经元损伤的治疗具有重要意义。神经干细胞可通过旁分泌效应发挥治疗作用，如释放神经营养因子、神经生长因子和脑源性神经营养因子等[4]。微囊泡（microvesicles）是由细胞分泌的一种微小膜性结构，可携带母细胞来源的活性物质，具有携带大量基因及蛋白质、低免疫原性等特点[5-6]。本实验通过建立大鼠背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）神经元H2O2氧化应激损伤模型,研究神经干细胞微囊泡（neural stem cell microvesicles, NSC-MVs）对大鼠DRG 神经元活力及凋亡的影响,并试图探寻其机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取第6 至8 代神经干细胞进行培养，提取微囊泡。选择新生SD 大鼠，SD 新生鼠购于江苏大学动物实验中心，实验遵循江苏大学伦理委员会规范，许可证号：SCXK 2018-0012。提取新生鼠DRG 神经元进行培养、鉴定。

1.2 仪器与试剂 Neurobasal 培养液，DF12，胰酶，胎牛血清，B27（美国Gibco 公司）。重组人碱性成纤维生长因子（bFGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、重组人表皮生长因子（EGF）、非必需氨基酸（NEAA）（美国PeproTech 公司）。兔抗大鼠cleaved caspase 3，cleaved caspase 9 一抗、LDH 检测试剂盒（沈阳万类生物科技有限公司）。β-tubulin Ⅲ（美国Abcam 公司）。兔抗大鼠Bcl-2，Bax 一抗（美国Affinity 公司）。山羊抗兔二抗（碧云天生物技术有限公司）。DAPI，BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）。流式试剂盒（美国BD 公司）。电泳仪（美国Bio-Rad 公司）。倒置显微镜（日本Nikon 公司）。马尔文Nanosight NS300 纳米颗粒跟踪分析仪（英国马尔文仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 NSC-MVs 提取：神经干细胞由胚胎干细胞分化所得[7]。培养于含B27，bFGF，EGF，NEAA的DF12 培养液中，置于5ml/dl CO2，37℃恒温培养箱。当细胞汇合度达到80%时，将原培养液更换为DF12 培养液，继续培养12 h，收集细胞上清。将收集的上清以2 000 g 转速离心30 min，以去除细胞碎片。随后以100 000 g 超速离心2h，弃上清，PBS 重悬后以相同条件进行二次离心。100μl PBS重悬，BCA 法测定蛋白浓度，置于-80℃保存。

1.3.2 大鼠DRG 神经元培养：将DRG 从新生鼠脊髓椎间孔取出，用眼科剪将神经节剪成0.5mm3碎块，置于胰酶中消化20 min。胎牛血清终止消化后将解离的DRG 神经元放置在多聚赖氨酸包被的培养皿中，培养皿中加入Neurobasal 培养液，2mmol/L L-谷氨酰胺，100 U/ml 青-链霉素，10 μmol/L 阿糖胞苷和2% B27。24 h 后更换1 次培养液，此后每3 天更换1 次。

1.3.3 微囊泡电镜及粒径分析：取10μl 微囊泡悬液于200目铜网上，静置10 min后吸去多余液体, 3%钨磷酸负染，5 min 后吸去多余钨磷酸, 80kV 电压下通过透射电子显微镜进行观察并选取合适视野拍照记录。PBS 稀释微囊泡至800 ～1 000 ml，取稀释后的样本，进样3 次，每次30 s。使用NTA2.3软件进行数据分析，通过手动快门和增益调整对样本进行分析，快门速度为15 或30ms，相机增益在280 ～560 之间。

1.3.4 神经元免疫荧光：吸净培养皿中培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞1 次。4g/dl 多聚甲醛室温固定30 min 后PBS 洗涤细胞3 次，每次5 min。使用0.1g/dl Triton X-100 室温作用10 min，PBS 洗涤1 次。1 g/dl BSA 封闭30 min，加兔抗鼠β-tubulin Ⅲ单克隆抗体（1∶100），湿盒中4℃孵育过夜。PBS 洗涤3 次，加对应荧光二抗孵育1h，DAPI 复染5 min，抗荧光淬灭封片剂进行封片，荧光显微镜观察并拍照。

1.3.5 细胞活力检测：DRG 神经元（1×106/孔）接种于96 孔板，培养7 天后进行H2O2损伤处理，按照前述方法进行MTT 测定[8]。波长490 nm 处酶标仪检测。确定作用浓度后对DRG 神经元进行不同浓度NSC-MVs（100，200 和400 μg/ml）预处理2 h，H2O2损伤后测定细胞活力。

1.3.6 流式细胞术：DGR 神经元（1×105/孔）接种于24 孔板，培养7 天后通过不同处理分为对照组、H2O2损伤组和NSC-MVs 保护组。胰蛋白酶消化，PBS 重悬。1 000 g 离心5 min 后，依次加入Annexin V 和PI，暗室反应15 min。置于冰上，1 h内进行流式检测。

1.3.7 蛋白质印迹：将不同组分（对照组、H2O2损伤组和NSC-MVs 保护组）DRG 神经元在裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂中裂解，提取总蛋白。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。在10g/dl 分离胶和5g/dl 浓缩胶中进行电泳。浓缩胶：80 V，30 min；分离胶：110 V，70 min。在350 mA 电流下转膜90 min，5g/dl 脱脂奶粉封闭2 h，然后与一抗β-actin，cleaved caspase3，cleaved caspase 9，Bax，Bcl-2（均1∶1 500）4℃孵育过夜，次日TBST 洗涤4 次，二抗（1∶2 500）孵育1 h，TBST 洗涤后化学发光检测。使用Image J 软件分析蛋白灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.4 统计学分析 使用GraphPad Prism 7.02 进行分析，数据以均数±标准差（±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 神经干细胞形态 见图1。倒置显微镜观察神经干细胞形态，神经干细胞大小均一，分布均匀，生长状态良好，呈典型的玫瑰花环状结构。

2.2 NSC-MVs 电镜及粒径分析 见图2。透射电镜观察结果见图2A，微囊泡呈茶托形或圆盘状小囊泡；轮廓清晰，外周可见完整的膜性结构，内含低电子密度物质。粒径分析见图2B，微囊泡直径分布为40 ～450 nm，较多聚集于100 nm 附近。

2.3 大鼠DRG 神经元荧光染色 见图3。DRG 神经元进行免疫荧光染色鉴定：蓝色荧光为细胞核团，红色荧光为神经元轴突标记蛋白β-tubulin Ⅲ。

2.4 NSC-MVs 提升DRG 神经元活力 将不同浓度H2O2作用于大鼠DRG 神经元以建立氧化应激损伤模型，MTT 结果显示，随着H2O2浓度的增加，细胞活力逐渐下降。与对照组相比，H2O2浓度为25μmol/L 时，细胞活力下降至84.4%（P＜0.01）。当浓度为50，100，200 μmol/L 时具有显著性差异，细胞活力分别为73.7%，69.8%，49.5 %（F=127.4，P＜ 0.01），即200μmol/L H2O2处理DRG 神经元时，细胞活力降至50%以下，故我们选用200μmol/L 浓度的H2O2进行实验。在后续实验中，经浓度为100，200 和400 μg/ml 的NSC-MVs 预处理的DRG 神经元，细胞活力得到明显提升，细胞活力分别为51.4 %，67.4 %和73.5 %，呈现一定剂量依赖性。当NSC-MVs 浓度为200 μg/ml 时即差异具有统计学意义（F=149.47，P=0.023），后续选择200 μg/ml 浓度的NSC-MVs 进行实验。

2.5 NSC-MVs 抑制DRG 神经元凋亡 流式结果显示见图4A。与对照组相比，H2O2损伤组DRG神经元凋亡明显增多，经NSC-MVs 处理后，神经元凋亡率显著下降（F=232.8,P＜0.01）。蛋白质印迹结果见图4B，相比于对照组，H2O2损伤组cleaved caspase 3，cleaved caspase 9，Bax 蛋白水平明显上调（F= 93.75，32.32，59.88，均P＜ 0.05），Bcl-2 明显下调（F= 65.43，P＜ 0.05），NSC-MVs逆转了这种趋势（均P＜0.05）。

图4 NSC-MVs 对DRG 神经元凋亡的影响

3 讨论

神经干细胞是神经系统不同发育阶段的初级祖细胞，具有自我更新和多向分化潜能。可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，从而为大脑提供大量脑细胞[9]。神经干细胞在抑制神经炎症和降低氧化应激方面发挥积极作用，但由于细胞去分化、畸胎瘤形成、免疫排斥反应、移植干细胞存活率低等问题限制了神经干细胞的临床应用[10-11]。微囊泡是一类由细胞产生和分泌的双层脂质微小膜性结构，存在于循环系统中，含有来自宿主细胞的多种蛋白质、脂质、mRNA，miRNA 甚至 DNA 等，促进细胞间通讯和调节受体细胞功能[12]。

相比于神经干细胞，NSC-MVs 则避免了上述缺陷。首先，在动物实验中，NSC-MVs 可以通过鼻内给药靶向运输至大脑不同区域。同时，微囊泡静脉或鼻内给药导致血栓形成（小血管阻塞）的可能性很小，因为其能够穿过血脑屏障并通过胞吞作用与质膜直接融合或与细胞表面蛋白和细胞黏附分子结合被转运到脑细胞中[13]。与细胞疗法不同，微囊泡不含细胞核，使其在释放后无法复制和快速分解，故微囊泡给药后发生肿瘤或恶性转化的可能性几乎为零。微囊泡还具有低免疫原性，随着新技术的出现，大规模生产治疗性囊泡前景广阔[14]。此外，由于微囊泡在-80℃条件下能够长期保存，在4℃条件下其生物活性能维持数周，方便储存和运输[15]。

目前，基于微囊泡的无细胞治疗策略已被广泛研究。神经干细胞是大脑中产生神经元和神经胶质细胞的直接细胞来源，这意味着NSC-MVs 可能表现出强大的神经源性潜力。YUAN 等[16]数据表明，神经干细胞衍生的外泌体含有高丰度miR-9，并证实通过转移 miR-9 促进神经干细胞的分化。ZHANG 等[17]研究表明，NSC-MVs 促进心肌细胞自噬，抑制细胞凋亡，并最终证实其通过转运热休克蛋白70 发挥保护作用。ZHONG 等[18]结果表明，神经干细胞外泌体可以增强脊髓微血管内皮细胞的血管生成活性，促进血管生成，减少脊髓腔，并证实通过转移血管内皮生长因子A（VEGFA）促进微血管再生和组织愈合。这些研究表明神经干细胞衍生的微囊泡或外泌体应用前景巨大，同时也为我们的研究提供了一些思路。

在本实验中，当神经干细胞汇合度达到80%时，立即更换培养液为DF12 基础培养液，避免了添加在培养液中细胞因子的干扰，12 h 后收集细胞上清，进行超速离心以提取微囊泡，并对其进行电镜和粒径分析。神经元体外培养是神经元生长分化、轴突再生、神经损伤疾病等研究的基础，以往多采用胎鼠神经元进行体外培养，但由于胎鼠孕期不易掌握以及可获得的神经元数量少等问题[19], 因此我们选择新生鼠代替胎鼠进行体外培养。本实验采用含有B27 的Neurobasal 培养液，B27 作为血清替代物，含有多种生长因子，能够抑制胶质细胞生长，促进神经元生长。H2O2被广泛应用于氧化应激损伤[20-21]，本实验通过使用不同浓度的H2O2模拟DRG 神经元氧化应激损伤，并最终选择半数抑制浓度200μmol/L H2O2进行后续实验。

神经元氧化应激损伤包括DNA 损伤、胞内Ca2+释放、蛋白质破坏、脂质过氧化、神经营养因子缺失等过程，最终引起神经元凋亡或坏死，而凋亡是受促凋亡基因和抑凋亡基因共同调控的细胞主动死亡的过程。Bcl-2 编码的蛋白质多分布于线粒体外膜和细胞膜内表面，作为抗凋亡蛋白，能够与Bax 前体结合，改变细胞膜通透性，从而介导细胞色素c 释放并启动caspase 9，并通过切割下游凋亡执行关键酶caspase 3 触发凋亡[22]。综上所述，其机制可能通过NSC-MVs 调控Bax/Bcl-2 表达，并激活下游cleaved caspase 9 和cleaved caspase 3，从而抑制神经元凋亡。尽管本实验提供了NSC-MVs 治疗神经元氧化应激损伤的依据，但由于NSC-MVs成分复杂，我们尚未发现其中发挥神经保护作用的基因或蛋白以及其进入细胞的具体过程，后续仍需对其成分进行分析和验证。