急性缺血性脑卒中患者血清Hcy，LncRNA CAI2和ERCC1表达水平与预测并发认知障碍的价值研究

石庆丽，贾嘉琦，李秀艳，陈奕菲，高玉苹，谭秀革

(北京市平谷区医院神经内科,北京 101200)

缺血性脑卒中为脑部供血动脉闭塞引发的血液循环障碍，可导致局部脑组织坏死，急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）在缺血性脑卒中发病后2 周内发生，AIS 其发病基础为动脉粥样硬化，具有较高的致死致残率，AIS 的主要并发症为认知障碍，可影响患者的日常生活，早期的诊断可减轻认知功能障碍的发生率[1]。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）在动脉粥样硬化与缺血性脑卒中的发生中具有重要作用[2]。长链非编码RNA CAI2（long non-coding RNA CAI2，LncRNA CAI2）参与多种病理的生理机制，在神经的生长发育与神经系统的功能中具有重要作用[3]。核苷酸切除修复交叉互补基因1（nucleotide excision repair cross complementary gene 1，ERCC1）为核酸切除修复的关键酶，可影响机体的修复能力与效率[4]。临床关于Hcy，LncRNA CAI2 和ERCC1 联合预测AIS 并发认知障碍的相关研究较少，基于上述研究背景，在本文研究中进一步验证Hcy，LncRNA CAI2 和ERCC1 在AIS 并发认知障碍患者中的表达，明确其是否参与疾病的发展，为临床上AIS 并发认知障碍的早期诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 回顾性分析北京市平谷区医院2018年5月～2020年5月收治的AIS 患者70 例作为研究组，其中，男性40 例，女性30 例，平均年龄62.71±11.62 岁，BMI 24.01±2.41kg/m2；其中高血压患者38 例，血糖水平＜7.8 mmol/L 25例，7.8 ～11.1mmol/L 24 例， ＞11.1mmol/L 21例。AIS 并发认知障碍患者112 例作为AIS 并发认知障碍组，男性55 例，女性57 例，平均年龄62.88±11.50 岁，BMI 24.01±2.41 kg/m2，其中高血压患者58 例，血糖水平＜7.8 mmol/L 38 例，7.8 ～11.1mmol/L 35 例，＞11.1mmol/L 39 例。另外选取同期在北京市平谷区医院体检的健康者70例作为对照组，男性38 例，女性32 例，平均年龄63.62±10.21 岁，BMI 23.62±2.51 kg/m2；三组患者男女比例、年龄、BMI 等一般资料均衡可比（P＞0.05）,患者及家属均知情同意本次研究，签署了知情同意书，且经过我院伦理委员会审核批准[批准号：（2018）伦审第（47）号]。

纳入标准：①研究组患者符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[5]中对于此病的诊治标准，患者为首次发病；②AIS 并发认知障碍患者符合《脑小血管病相关认知功能障碍中国诊疗指南(2019)》[6]中对于AIS 并发认知障碍的诊治标准，患者记忆力减退，语言能力受损。

排除标准：①研究组患者排除并发脑出血、意识障碍、听觉障碍，患者心肝肾功能异常；②AIS并发认知障碍患者排除严重视力障碍患者、肺缺血性脑卒中引起的认知障碍患者、心肝肾功能异常患者。

1.2 仪器与试剂 全自动生化分析仪（济南鑫贝西生物技术有限公司，型号：BK-400）,Takara 试剂盒（上海原鑫生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 Hcy 检测方法：采集所有患者清晨空腹静脉血4ml，以离心半径5cm，转速3 000r/min 离心处理10min，分离上层血清，-80℃保存待检。采用全自动生化分析仪检测Hcy 水平。

1.3.2 LncRNA CAI2，ERCC1 检测方法：实时荧光定量PCR 检测LncRNA CAI2，ERCC1 水平。采用Takara 逆转录试剂盒将RNA 逆转录为cDNA，逆转录反应体系：0.4 μl 上下游引物，1μl cDNA模板，10 μl SYB Green，加蒸馏水至20 μl。反应条件：92℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 30s，进行40个循环，采用2-△△Ct方法计算出LncRNA CAI2，ERCC1 表达量，LncRNA CAI2 上游引物序列：5’-GAAGGCGTGAAGATGTGG-3’，下游引物序列：5’-GTGGGTTTGTAGAAGCAGGC-3’；ERCC1上游引物序列：5’-GAGCCTCAAGGGAAAGACTG C-3’，下游引物序列：TCGCCCTGCTCTATGCTC TACT-3’，内参U6 引物序列：上游：5’-CCACGAA ACTACCTTCAACTCC-3’，下游：5’-GTGATCTCCT TCTGCATCCTGT-3’。

1.3.3 AIS 并发认知障碍严重程度分级标准：采用简明精神状态量表对患者认知功能进行评价，该量表共有7 个条目，包括时间定向力、注意力、语言、视空间、延时记忆、即刻记忆、计算力，总分为30分，轻度认知障碍为21 ～26 分，中度认知障碍为10 ～20 分，重度认知障碍为＜10 分。

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0 统计软件包进行统计分析处理。计量资料采用均数±标准差（±s）描述，多组间比较采用方差齐性检验，两组间比较采用独立样本t检验，Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1之间相关性采用Pearson 相关性分析。ROC 曲线分析Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 对AIS 并发认知障碍的预测价值，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hcy，LncRNA CAI2 和ERCC1 在对照组、研究组、AIS 并发认知障碍组中的表达对比 见表1。与对照组、研究组相比，AIS 并发认知障碍组Hcy，LncRNA CAI2 表达升高，ERCC1 表达降低，差异均具有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 在对照组、研究组、AIS 并发认知障碍组中的表达对比（±s）

表1 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 在对照组、研究组、AIS 并发认知障碍组中的表达对比（±s）

项 目对照组（n=70）研究组（n=70）AIS 并发认知障碍组（n=112）FP Hcy（μmol/L）9.58±0.9915.36±1.5522.35±2.4064.4360.001 LncRNA CAI21.11±0.151.62±0.181.85±0.2039.9280.001 ERCC11.26±0.140.91±0.080.76±0.0747.9590.001

2.2 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 与AIS 并发认知障碍严重程度的关系分析 见表2。随着AIS 并发认知障碍严重程度的加重，Hcy，LncRNA CAI2的表达逐渐升高，ERCC1 的表达逐渐降低，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 与AIS 并发认知障碍严重程度的关系分析（±s）

表2 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 与AIS 并发认知障碍严重程度的关系分析（±s）

项 目轻度（n=45）中度（n=45）重度（n=22）FP Hcy（μmol/L）16.62±1.7018.75±1.8623.62±2.3620.8270.001 LncRNA CAI21.75±0.171.82±0.191.91±0.205.1190.001 ERCC10.88±0.090.75±0.080.67±0.0714.4050.001

2.3 影响AIS 并发认知障碍严重程度的因素分析 见表3。将AIS 并发认知障碍作为因变量，将Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 作为自变量，纳入回归模型分析，结果显示，Hcy，LncRNA CAI2 水平升高，ERCC1 水平降低为影响AIS 并发认知障碍严重程度的因素（均P＜0.05）。

表3 影响AIS 并发认知障碍严重程度的因素分析

2.4 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 之间相关性分析 相关性分析显示，Hcy 与LncRNA CAI2 呈正相关（r=0.577，P=0.001）；Hcy 与ERCC1 呈负相 关（r=-0.561，P=0.001）；LncRNA CAI2 与ERCC1 呈负相关（r=-0.511，P=0.001）。

2.5 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 对AIS 并发认知障碍的预测价值 见表4，图1。ROC 曲线显示，与Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 单项诊断相比，三项联合对AIS 并发认知障碍的预测价值较高（P=0.001）。

表4 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 对AIS 并发认知障碍的预测价值（%）

图1 Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 预测AIS 并发认知障碍的ROC 曲线

3 讨论

急性缺血性脑卒中（AIS）的发病机制较为复杂，可能与血栓形成、心房颤动、高血压相关。研究表明[7]，血糖为危重病的严重并发症之一，血糖水平升高可导致患者产生并发症，加重患者病情，还可降低闭塞血管支配局域的脑组织血流灌溉，使患者脑组织缺血、缺氧，导致AIS 的发生。AIS 发病突然且迅速，故在急性期进行有效干预具有重要作用[8]。认知功能为人类在觉醒状态下存在的有意识的精神活动与学习新事物的能力，认知功能障碍指患者学习与解决问题的能力降低，判断力下降，其原因可能与患者神经元结构功能出现退化相关，急性脑卒中发生后可使血管闭塞，血流量降低，使患者脑细胞内缺乏氧气与营养，发展为血管性痴呆，还可使患者脑部小血管出现病变，影响思维逻辑能力、判断力，给患者的日常生活带来不便[9-10]。

同型半胱氨酸（Hcy）为体内蛋氨酸代谢的产物，且高水平的Hcy 可促使氧自由基的生成，使血管内皮发生损伤，动脉平滑肌细胞增生，在动脉粥样硬化形成中具有重要作用，还可诱导自身免疫反应，在血管内皮表面产生抗原抗体复合物，使巨噬细胞融合并形成泡沫细胞，增加AIS 的发生率[11]。临床研究显示[12-13]，Hcy 为影响AIS 并发认知障碍的独立因素，可损伤血管壁结构，且认知功能出现障碍与脑血管疾病具有相关性。Hcy 甲基化产物可抗抑郁与痴呆，Hcy 水平升高可使神经递质受到影响，使认知障碍发生的风险加大[14]。在本文研究中，Hcy 表达升高可导致病情加重，其原因可能为Hcy升高导致患者产生自由基，影响血管内皮细胞形态，并损伤血管内皮细胞功能，使内皮细胞释放一氧化碳的能力降低，Hcy 升高还可减弱血管舒张功能，Hcy 存在细胞毒性，可使血管内皮增厚，降低血管顺应性，增加细胞表皮氧化性，降低生物活性，促使代谢增高与血压增强，并使血管因子的活性受到刺激，增加血小板黏附功能，影响血栓调节素的形成，增加血栓形成的风险，导致认知障碍的发生。

长链非编码RNA(LncRNA)为大于200 个核苷酸的非编码RNA，广泛存在于脑组织中，并参与脑缺血与卒中的康复[15-16]。AIS 的大脑二次损伤与神经兴奋毒性，氧化应激与神经炎症反应相关，且AIS患者的大脑二次损伤可使其神经康复受到阻碍，LncRNA ANRIL 表达下调与脑卒中疾病的严重程度与炎症反应呈正相关[17]。CAI2 位于9 号染色体，在多种肿瘤细胞中高表达[18]。研究表明，LncRNA在AIS 中表达水平相对于短暂性脑缺血发作患者较高，可用于对AIS 的诊断，CAI2 在多种肿瘤中高表达。本文研究发现，LncRNA CAI2 表达与患者的病情严重程度相关，且参与该病的发展，可用于该病的诊断，其原因可能为LncRNA CAI2 使患者的神经炎症反应加重，神经凋亡加快，使大脑受到损伤，并影响其康复，促进了认知障碍的发展，临床上可根据其表达程度预测此病。

NER 系统为DNA 主要的修复机制，在多种肿瘤的发生、发展中具有重要作用，ERCC1 可代表NER 系统的活性，且ERCC1 基因的表达与细胞的分化有关，随着细胞分化程度的变差，修复功能逐渐降低[19]。ERCC1 基因序列甲基化可抑制基因的表达，机体产生AIS 时，影响ERCC1 基因的表达，使神经细胞内损伤DNA 分子的修复受到影响，并使AIS 反复发作[20]。AIS 发生时，缺血区与正常灌注区可形成缺血半暗带，使其受到炎性细胞的浸润，促进自由基的释放，与神经细胞内DNA 结合，使DNA 碱基断裂，并造成断裂DNA 集聚，使神经细胞内功能产生紊乱，加剧缺血性脑损伤[21]。本文进一步分析显示，ERCC1 水平为影响AIS 并发认知障碍发生的因素，其原因可能为缺氧使机体激活ERCC1 基因的功能受到抑制，无法诱导ERCC1 基因进行表达，使机体NER 系统的修复能力与修复效率降低，并使大量损伤DNA 分子在脑损伤处堆积，影响基因组的稳定性，加重脑组织的损伤，并引起AIS 患者的认知障碍。另外本文采用相关性分析Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 之间的关系，结果发现，Hcy 与LncRNA CAI2 呈正相关，Hcy 与ERCC1 呈负相关，LncRNA CAI2 与ERCC1 呈负相关，提示三者可能共同参与此病的发生进展，但本文纳入样本量较少，且为回顾性研究，结果可能具有一定的偏倚，本文未对患者的预后进行研究，且未深入分析Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1AIS 在并发认知障碍中的具体作用机制，因此本文结果还需后续研究进一步分析，以明确三者参与AIS 并发认知障碍的作用机制及对患者预后的影响，为临床上此病的诊治提供参考。

综上所述，AIS 并发认知障碍的发生可使Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 表达发生变化，且相关性分析显示三者具有相关性，推测Hcy，LncRNA CAI2，ERCC1 共同参与此病的发生发展，可作为临床上预测AIS 并发认知障碍的重要指标。