lncRNA THRIL和miR-300在新生儿败血症患者中的临床意义

矫 岩，石 岩，韩文超，刘文东，王晓琴

(青岛市市立医院儿科，山东 青岛 266000)

新生儿败血症是危重感染疾病之一，病原菌或条件致病菌感染后入血，并在血液中增殖，引起新生儿全身感染[1]。新生儿机体免疫球蛋白合成能力不足，免疫功能发育尚不完全，病原菌入血后呈爆发性进展，且新生儿败血症前期症状隐匿，可能会造成临床医生误判而延误治疗，造成新生儿出现多器官衰竭甚至死亡[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)在转录及转录后水平调控基因的表达，影响机体生理病理进程[3-4]，其在包括脓毒症及败血症在内的各炎症性疾病中多有报道，如长链非编码RNA-肿瘤坏死因子相关异种核蛋白L(long non-coding RNA-tumor necrosis factor-related and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-related immunoregulatory，lncRNA THRIL)对脓毒症并发呼吸窘迫患者预后具有一定预测价值[5]。miR-21联合降钙素原(procalcitonin，PCT)对脓毒症诊断和病情动态变化都具有良好的预测价值[6]。但是目前lncRNA和miRNA在新生儿败血症的作用如何还鲜有报道。基于此，本研究探讨lncRNA THRIL和miR-300在新生儿败血症患者的表达情况及与炎性因子的相关性，并探索两者预测新生儿败血症预后的价值。

1资料与方法

1.1一般资料

将2016年6月至2021年9月青岛市市立医院收治的132例新生儿败血症患儿作为试验组。纳入标准：①符合《新生儿败血症诊断及治疗专家共识》中新生儿败血症的诊断标准[7]：白细胞计数(white blood cells，WBC)、PCT、C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、血小板计数中两项结果呈阳性；②经血培养显示细菌感染；③日龄≤28d；④入院前未使用抗生素治疗。排除标准：①合并遗传代谢性疾病患儿；②合并免疫缺陷性疾病或严重血液系统传染病患儿；③入院前使用抗生素或抗菌药物治疗患儿；④严重先天畸形，凝血功能异常者；⑤合并严重肝肾功能不全或先天心脏病患儿。另选择同期住院的77例非败血症一般感染新生儿为对照组，两组受试者监护人均签署知情同意书，并通过医院伦理委员会批准同意。

试验组患儿男60例，女72例；日龄1～28d，平均日龄(16.26±3.28)d；平均体重(3.89±1.29)kg。对照组患儿男41例，女36例；日龄1～28d，平均日龄(17.01±4.29)d；平均体重(3.92±1.32)kg。两组患儿性别组成、年龄、体重差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 lncRNA THRIL和miR-300表达检测

采用实时荧光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)检测lncRNA THRIL和miR-300表达。两组受试者入院时采集静脉血5mL，3 000rpm离心15min(离心半径10 cm)后抽取血清，采用TRIzol试剂盒(Sigma-Aldrich，美国)抽提血清总RNA，琼脂糖凝胶或分光光度计检测其浓度及纯度，对纯度合格的RNA进行反转录；取1μg RNA反转录为cDNA(miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，primescript RT reagent kit with gDNA Eraser试剂盒，Takara)和lnRcute lncRNA cDNA 链合成试剂盒(天根生物有限公司，中国)反转录为cDNA；使用SYBR miRNA RT-PCR Kit(Takara，日本)和lnRcute lncRNA荧光定量检测试剂盒；RT-PCR反应体系：SYBR Green Mix 5.0μL，PCR F Primer 0.2μL，PCR R Primer 0.2μL，cDNA模板2μL，ddH2O 2.6 μL。RT-PCR扩增引物见表1，引物由上海生工设计合成，扩增程序：95℃预变性15 min，(95℃ 30s，60℃ 35s)×35个循环；反应完毕后，实验数据采用ABI700软件分析，以GAPDH，U6为内参按照2-△△Ct进行相对定量分析。

表1 RT-PCR扩增引物序列

1.3血清学指标检测

采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测炎性因子白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，严格按照试剂盒说明操作(ELISA试剂盒购自Abcam公司)；采用免疫色谱法检测PCT，由HR201检测仪分析；采用全自动生化分析仪(Olympus公司)对新生儿血清进行CRP和WBC检测。

1.4预后及分组

根据患儿是否好转分为预后良好组(n=91)和预后不良组(n=41)，预后良好组患儿败血症明显好转，WBC、PCT等血清学指标恢复正常且无后遗症；预后不良组患儿包括死亡、脑积水、支气管肺发育不良等严重后遗症。

1.5统计学方法

2结果

2.1不同组受试者lncRNA THRIL和miR-300表达差异

对两组数据进行正态性检验，两组数据均成正态分布(P>0.05)；试验组lncRNA THRIL表达量高于对照组，差异有统计学意义(2.32±0.53 vs 1.34±0.41，t=-8.283，P<0.001)；试验组miR-300表达量高于对照组，差异有统计学意义(1.89±0.39 vs 1.28±0.30，t=-7.596，P<0.001)，见图1。

图1 不同组受试者lncRNA THRIL和miR-300表达差异

2.2两组受试者血清学指标差异

与对照组相比，试验组患儿血清WBC、PCT、CRP、IL-6、TNF-α水平升高，差异有统计学意义(t/Z值分别为-4.926、-28.327、-14.658、-15.451、-11.958，P<0.05)，见表2。

表2 两组受试者血清学指标差异

2.3 lncRNA THRIL、miR-300联合PCT对新生儿败血症的早期诊断价值

采用ROC曲线评估lncRNA THRIL、miR-300、PCT对败血症患儿的诊断价值，结果显示三指标联合诊断的AUC最高，为0.975，敏感度、特异性分别为0.871、0.974，见表3、图2。

表3 lncRNA THRIL、miR-300、PCT诊断败血症患儿的ROC曲线分析

图2 lncRNA THRIL、miR-300、PCT诊断败血症的ROC曲线

2.4 lncRNA THRIL、miR-300与败血症血清学指标的相关性

采用Spearman相关性分析检验lncRNA THRIL和miR-300与败血症血清学指标的相关性，结果显示lncRNA THRIL、miR-300与PCT、CRP、IL-6、TNF-α均呈正相关关系(r值介于0.269～0.441之间，P<0.05)，见表4。

表4 lncRNA THRIL和miR-300与败血症血清学指标的相关性

2.5 lncRNA THRIL、miR-300对败血症患儿的预后评估

绘制ROC曲线评估lncRNA THRIL和miR-300对败血症患儿预后的预测价值，结果显示两指标联合预测AUC最高，为0.867，敏感度和特异性分别为0.780、0.824，见图3、表5。

图3 lncRNA THRIL、miR-300评估败血症患儿预后的ROC曲线

表5 lncRNA THRIL、miR-300评估败血症患儿预后的ROC曲线分析

3讨论

3.1新生儿败血症严重影响新生儿的生命健康

败血症是由于感染的病原菌入血并在血液中增殖，随着血液循环造成的全身感染。新生儿机体免疫功能低下，抗感染能力差，故新生儿败血症是新生儿科最为棘手的危重症之一[8]。新生儿败血症早期无全身特异性临床表现，与一般感染无异，但其病情进展迅速，严重影响新生儿的生命健康。所以筛选多个生化标志物，进行多指标联合早期诊断对新生儿败血症的治疗及预后尤为重要。

培养是新生儿败血症诊断的“金标准”，但所耗时间较长，且培养率低。PCT作为血清降钙素的前体，其血清水平与系统性炎症反应密切，常被用来作为细菌真菌感染、肺炎及败血症的早期诊断[9]。本研究发现与一般感染的新生儿相比，败血症患儿PCT水平显著升高，其作为新生儿败血症早期诊断的ROC曲线下面积为0.858，敏感度和特异性分别为0.735、0.882，该结果与以往报道一致[10]。

3.2 lncRNA THRIL、miR-300对新生儿败血症的早期诊断具有一定效能

lncRNA和miRNA是机体两大类非编码RNA，miRNA可以与靶基因的3′UTR结合，降低靶基因表达；lncRNA可以作为miRNA的“分子海绵”，与miRNA形成ceRNA网络而调控下游基因的表达，进而影响肿瘤的发生发展、炎症反应进展等各类生命活动[11-12]。lncRNA THRIL和miR-300在炎症疾病中发挥重要作用，Li等[13]通过动物实验发现miR-300能通过激活AMPK/mTOR信号通路在脓毒症中调节炎症反应，他们发现miR-300靶向结合NAMPT基因来增强细胞自噬并抑制细胞凋亡，增强内皮细胞周期而影响脓毒症进展，以上结果表明miR-300能够影响炎症反应发生并影响脓毒症进展。本研究发现miR-300在败血症患儿血清中高表达，其诊断败血症的曲线下面积为0.809；进一步探究其与炎性因子TNF-α、IL-6、CRP和PCT的相关性，发现miR-300与炎性因子水平呈明显的正相关；且本研究发现miR-300对脓毒症预后评估的AUC为0.770，该结果表明miR-300在新生儿败血症的早期诊断中有一定作用，且能通过影响炎性因子水平影响脓毒症进展，对脓毒症预后有一定预测价值。

THRIL可以通过调控TNF-α水平而影响炎症反应，Chen等[14]发现THRIL可以通过调节miR-424/ROCK2轴加重脓毒症小鼠的急性肺损伤。另有研究表明THRIL在脓毒症患者中表达上调，其可作为miR-19a的“分子海绵”进而上调人支气管上皮细胞中的TNF-α水平[15]。与脓毒症相似，本研究发现新生儿败血症患儿中THRIL表达上调，且与TNF-α呈显著正相关，对新生儿败血症的早期诊断AUC为0.838，预后预测的AUC为0.802；THRIL、miR-300和PCT对败血症早期诊断联合分析，其AUC为0.975，该结果表明将各生化指标联合分析后，诊断效能大大提高，在后期临床中也可使用多指标联合分析诊断新生儿败血症。THRIL和miR-300对败血症预后评估联合分析，AUC为0.867，预测效能也明显提高。

综上，miR-300和lncRNA THRIL在新生儿败血症患儿血清中表达显著提高，对新生儿败血症的早期诊断具有一定效能，可联合常用的PCT、CRP等生化指标用于新生儿败血症的早期诊断。两者皆与炎性因子有显著相关性，可能通过调控炎性因子水平从而影响败血症进展，所以对败血症的预后有一定预测价值。在后期研究中我们还需进一步探究两者对炎性因子的调控机制。