妊娠早期高雌激素暴露对小鼠子代体重及胎盘的影响

马 蓉，陈书强，雷 辉，金 妮，王晓红

(空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，陕西 西安 710038)

低出生体重(low birth weight，LBW)是评价妊娠结局的一个重要指标，LBW儿的患病率和死亡率较正常体重新生儿显著升高，且其成年后患肥胖、糖尿病、高血压等慢性疾病的风险也显著增加[1-2]。辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)是当前治疗不孕症的主要手段，越来越多的证据表明，通过ART受孕分娩的新生儿发生LBW的风险是自然受孕分娩新生儿的3倍[3-6]。与冷冻周期相比，新鲜周期LBW的发生风险显著增加[6-7]。作为辅助生殖技术中的一个关键步骤，控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)应用大剂量促性腺激素促进多个卵子成熟，使母体处于非生理性的高雌激素状态。研究表明，孕妇妊娠前三个月子宫暴露于高雌激素环境可能增加子代LBW的风险[8-9]。然而，很少有研究探讨高雌激素暴露导致低体重风险的机制。本研究通过建立动物模型来进一步探究该因果关系。为了尽可能平衡混杂因素，我们采用外源性雌二醇(estradiol，E2)补充以建立高E2模型，使得两组的唯一差异是妊娠早期的E2水平。本研究旨在建立小鼠模型以证实高雌激素暴露导致子代低体重的作用，并进一步探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1实验材料

①实验动物：SPF级8～10周龄、体重28～32g的健康雌性ICR小鼠，及8～10周龄、体重34～40g的雄性小鼠，购于北京华阜康生物科技公司。②实验药物：戊酸雌二醇(MCE HY-B0672)，使用时以玉米油(Glpbio GC32712)稀释至使用浓度100μg·kg-1·d-1。③研究的主要试剂如下：放射免疫法雌激素检测试剂盒(北京华英生物技术研究所)，HE染色试剂盒(索莱宝 GII20)，PAS染色试剂盒(索莱宝 G1281)，RIPA中蛋白裂解液(碧云天)，BCA定量试剂盒(Thermo)，Luminex液相悬浮芯片检测试剂盒(R&D Systems)。④主要仪器包括：电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、XH-6020全自动放免计数仪(北京华英生物技术研究所)、组织包埋中心(武汉塞维尔生物科技有限公司)、干烤箱(上海一恒科学仪器有限公司)、超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、悬液微珠芯片平台Bio-Plex MAGPIX System(上海华盈生物医药科技有限公司)。

1.2实验分组与动物造模

对购入的ICR小鼠进行1周适应性喂养，选择性成熟自然发情的雌鼠与正常雄鼠1：1合笼，次日上午8：00检查雌鼠，见阴道栓者记为妊娠0.5天。按随机数字表法将其分为对照组(NC组)和高雌激素组(EV100组)，每组7只。高雌激素组在见栓后第5.5～12.5天每日上午9：00给予口服溶于玉米油的17β-戊酸雌二醇(100μg·kg-1·d-1)，对照组给予相同体积的玉米油。

1.3观察指标与检测方法

①于妊娠12.5天给药后3小时，眼球取血收集小鼠外周血(高雌激素组和对照组小鼠各5只)，室温静置后3 000rpm离心10分钟，3 000rcf离心10分钟，取血清冻存于-80℃冰箱，通过放射免疫法测定小鼠血清雌激素水平，验证造模是否成功。②于妊娠14.5天解剖子宫(高雌激素组和对照组小鼠各7只)，分离出胎鼠、胎盘，电子天平称重并记录。③HE染色观察胎盘形态：胎盘固定于4%多聚甲醛，常规脱水包埋，切片，60℃烤片2小时，常规脱蜡，苏木素染核2分钟，酸分化液分化后置伊红染液染色后常规脱水、透明、封片。④PAS染色观察胎盘形态：切片常规脱蜡，氧化剂室温5分钟，Schiff Reagent试剂室温20分钟，自来水冲洗10分钟，苏木素染核2分钟，酸分化液分化后自来水冲洗10分钟，常规脱水、透明、封片。⑤Luminex液相悬浮芯片技术检测胎盘生长相关细胞因子的蛋白表达：组织样本蛋白抽提(RIPA中裂解液)，BCA法蛋白定量(Thermol)，取200微克等质量上样检测，经过样品孵育、孵育检测抗体、显色等步骤，送入已校正的Bio-Plex机器中读值。根据标准品得到的荧光检测值，使用多参数模式对标准曲线进行拟和，得到标准曲线及其方程，浓度单位为pg/mL。

1.4统计学方法

2结果

2.1两组小鼠雌激素水平的比较

EV100组小鼠血清中雌激素水平显著高于NC组，两组之间差异具有统计学意义(t=4.698，P<0.01)，模型建立成功，见表1。

表1 两组小鼠雌激素水平的比较

2.2两组小鼠妊娠14.5天子代体重、胎盘重量和胎盘效率的比较

两组小鼠的窝仔数无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。EV100组小鼠的子代体重明显低于NC组，差异有统计学意义(t=4.932，P<0.05)；EV100组小鼠胎盘重量和胎盘效率(胎儿重量/胎盘重量)均明显低于NC组，差异有统计学意义(t值分别是2.639、2.336，P<0.05)，见表2。

表2 两组小鼠妊娠14.5天子代体重、胎盘重量、胎盘效率比较

2.3两组小鼠妊娠14.5天胎盘结构比较

HE染色和PAS染色均显示，妊娠14.5天EV100组小鼠胎盘迷路区占胎盘总面积的比例较NC组减少，差异有统计学意义(t值分别是3.819、4.800，P<0.05)，见表3和图1。

表3 两组小鼠妊娠14.5天胎盘结构比较

(A)NC组HE染色；(B)EV100组HE染色；(C)NC组PAS染色；(D)EV100组PAS染色

2.4两组小鼠妊娠14.5天胎盘相关细胞因子的比较

EV100组小鼠的胎盘基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)和胰岛素样生长因子-1(insulin like growth factor-1，IGF-1)表达水平明显比NC组低，差异有统计学意义(t值分别是12.270、15.630，P<0.05)，见表4。

表4 两组小鼠妊娠14.5天胎盘生长相关细胞因子蛋白表达的比较

3讨论

3.1妊娠早期高雌激素暴露可导致子代出生体重降低

低出生体重被认为是评估新生儿和婴儿发病率和死亡率的重要指标，研究表明低出生体重儿在以后的生活中发生胰岛素抵抗、糖尿病、高血压、心血管疾病等慢性疾病和某些癌症的风险更高[10]。近年来，辅助生殖技术的快速发展给越来越多不孕症患者带来了福音，但其中控制性超促排卵这一关键步骤会使妊娠早期母体处于超生理性高雌激素状态。既往研究表明，妊娠早期高雌激素环境与低出生体重的发生风险增加相关[3-5]。本研究通过建立小鼠模型以进一步探究妊娠早期高雌激素暴露导致子代低出生体重的发生机制。我们采用外源性E2补充来建立高E2模型，以尽可能平衡混杂因素，使得两组之间的唯一差异是妊娠早期的雌激素水平。研究结果显示，EV100组小鼠血清雌二醇浓度是对照组的4倍，EV100组小鼠子代体重显著低于对照组，证实了出生体重的下降是由于胎儿暴露于超生理性的高雌激素环境所致。

3.2妊娠早期高雌激素暴露可导致胎盘重量和效率降低

胎盘在胎儿的生长和发育中起着关键作用，可合成一系列具有代谢和生长调节作用的细胞因子，在母亲和胎儿之间分配营养物质，进行气体交换，清除代谢废物，帮助调节妊娠进程[11]。胎盘效率通常定义为出生体重与胎盘重量之比，即每克胎盘产生的胎儿克数。胎盘效率是衡量胎盘发育和胎盘功能，特别是衡量营养物质转移到胎儿的替代指标。胎盘测量和妊娠结果之间的关联已经建立，研究表明较低的胎盘效率将导致新生儿低Apgar评分和出生后死亡风险增加，成年后疾病发展的风险显著增高等[12]。本研究发现，EV100组小鼠的胎盘重量和胎盘效率均显著低于对照组，即妊娠早期高雌激素暴露导致胎盘重量和胎盘效率降低。

3.3妊娠早期高雌激素暴露可影响胎盘形态结构

胎盘是一种主要存在于哺乳动物体内的器官，与母体组织直接接触，将发育中的胎儿与母体子宫壁连接在一起，血液中循环的任何物质都必须通过胎盘才能到达胎儿。虽然是短暂的，但胎盘与母体子宫有密切的接触，并在营养、气体和废物交换中发挥各种作用[13]。胚胎着床和蜕膜化后，胎盘发育的一个关键步骤是胎盘迷路区的形成。胎盘迷路区是位于胎盘胎儿一侧的结构，主要由滋养层细胞和内皮细胞组成。滋养层细胞是着床后滋养外胚层的衍生物，而内皮细胞来自胚胎尿囊中胚层，这两个并列的层为气体、营养物质、胚胎代谢最终产物和其他分子在胚胎和母体之间的双向转运提供了界面，因此其正确形成对胎儿的发育至关重要[14-15]。有研究表明，小鼠胎盘迷路区在母体和胎儿之间交换营养物质和气体，该胎盘区域结构复杂，其形成缺陷会影响物质交换，从而影响胎儿的生长和活力[16]。本研究通过HE染色及PAS染色对小鼠胎盘的组织形态结构进行分析，结果表明妊娠早期高雌激素暴露导致小鼠胎盘迷路区面积占胎盘总面积的比例显著减少。

3.4胎盘相关细胞因子表达降低可能是导致胎盘结构改变及子代低出生体重的重要原因

本研究对小鼠胎盘功能检测后发现，EV100组小鼠MMP-2、IGF-1的表达水平较对照组显著降低，这可能是妊娠早期高雌激素暴露导致小鼠胎盘结构改变及子代低体重的重要原因。MMPs是降解细胞外基质和结缔组织蛋白的一类蛋白酶，在正常和病理血管生成中发挥重要作用[17]。研究发现，MMP-2在妊娠各阶段均有表达，可在妊娠的重要阶段发挥作用，包括滋养层侵袭、血管形成、着床和胎盘形成等[18]。MMP-2在人的月经周期和动物的发情周期及妊娠过程中参与子宫内膜组织重塑。此外，MMPs还可影响子宫和血管功能以及平滑肌收缩机制[19]。免疫组化研究显示，正常妊娠大鼠子宫、胎盘和主动脉均有明显的MMP-2染色，提示MMPs在子宫和血管重塑中发挥作用，而子宫MMPs表达的降低可能导致子宫收缩增加和早产[20]。然而，MMPs在组织重塑中的作用、受影响的下游靶点及其作用机制尚不清楚。

IGF-1在胚胎期和出生后均起着重要的作用，对正常胎儿和胎盘的生长发育至关重要。在妊娠期间，胎盘是IGF-1的主要来源之一。宫内生长受限(intrauterine growth restriction，IUGR)定义为无法达到妊娠期预期体重,是围产期发病率和死亡率较高的第二大常见原因。研究表明，IUGR婴儿有胎盘功能障碍和低水平的IGF-1表达。这些数据提示，妊娠期IGF-1缺乏可能是胎儿发育迟缓的主要原因之一[21]。胎盘重量、迷路区面积、滋养层丰度、厚度和血管密度等都与妊娠后期母体IGF-1浓度直接相关；IGF-1并不直接参与胎盘的生长，但可能在调节胎盘营养转运能力的适应中起关键作用，从而改变胎盘效率[22]。

综上所述，妊娠早期母体暴露于高雌激素环境可导致小鼠胎盘结构发生明显改变，小鼠子代体重和胎盘重量显著降低，而胎盘中MMP-2、IGF-1的表达水平显著降低可能是其中的重要原因。