circGFRA1靶向miR-138-5p调控宫颈癌SiHa细胞生物学行为*

汤雪龄， 刘 柳， 蒋沛月

浙江大学医学院附属妇产科医院妇产科，杭州 310003

宫颈癌(cervical cancer，CC)是发病率较高且死亡率较高的妇科恶性肿瘤，其发病率近年来呈增高及年轻化趋势，严重威胁女性的生命安全。宫颈癌发生及发展过程涉及多基因、多因素，而宫颈癌转移是导致患者治疗效果降低及预后差的主要原因[1-2]。环状RNA(circular RNA，circRNA)具有闭合环状结构，在转录水平、转录后水平上调控基因表达从而参与细胞生物学过程。circGFRA1是近年来研究比较多的一种circRNA。报道显示，circGFRA1可通过调节微小RNA(microRNA，miRNA)表达，调节RNA结合蛋白与核转录参与或影响恶性肿瘤的发生发展，如circGFRA1在胶质瘤细胞中表达水平升高，下调circGFRA1可促进microRNA-99a表达并抑制胶质瘤细胞增殖和迁移。研究表明circRNA在宫颈癌中表达异常，并可参与宫颈癌发生及发展过程[3-5]。但circGFRA1对宫颈癌细胞生物学行为的影响及其可能作用机制报道较少。另外，miR-138-5p在宫颈癌细胞表达水平较低，提高其表达水平能够抑制宫颈癌细胞增殖及转移[6]。我们研究团队进行的预实验显示，circGFRA1与miR-138-5p存在靶向关系，但尚未有学者阐明circGFRA1/miR-138-5p分子轴在宫颈癌发生及发展过程中的具体机制。因此，本研究通过分析circGFRA1能否靶向调控miR-138-5p表达从而调节宫颈癌细胞生物学行为，为宫颈癌的防治提供参考，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料及实验试剂

选取2020年3月至2020年7月浙江大学医学院附属妇产科医院确诊的宫颈癌患者共45例，取其癌组织及其癌旁组织(≥5 cm处的组织)标本，癌组织均经病理学诊断确诊为宫颈癌。患者年龄48～66岁，平均年龄(53.38±4.16)岁。组织标本在术后转移至-80℃超低温冰箱保存。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者；术前接受放疗或化疗患者。纳入本研究患者均签署知情同意书，且研究中收集的临床资料及研究结果均采取保密措施，不做其他用途，本研究已获浙江大学医学院伦理委员会批准。

DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT试剂均购自上海碧云天生物公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；Trizol试剂购自美国Thermo Fisher公司；反转录与SYBR Green试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；si-NC、si-circGFRA1、anti-miR-NC、anti-miR-138-5p、miR-NC、miR-138-5p mimics均购自广州锐博生物科技有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；野生型载体wt-circGFRA1、突变型载体mut-circGFRA1及其活性检测试剂盒均购自美国Promega公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗体与内参GAPDH抗体均购自美国Abcam公司。

1.2 细胞转染及分组

将宫颈癌SiHa细胞放入含10%胎牛血清的DMEM完全培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养。将SiHa细胞接种到6孔板，当细胞生长融合达到70%时转染。转染方法：将不含胎牛血清的DMEM培养液分别与si-NC、si-circGFRA1、anti-miR-NC、anti-miR-138-5p混合，室温孵育5 min(A液)，将不含胎牛血清的DMEM培养液与Lipofectamine 2000转染试剂充分混合(B液)，A液与B液充分混匀后室温孵育20 min，按分组将混合液加入6孔板中，每孔200 μL，置于培养箱内培养6 h，弃培养液，更换为含有10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养48 h。实验分组：采用上述转染方法将si-NC、si-circGFRA1分别转染至SiHa细胞，分别记为si-NC组、si-circGFRA1组；将si-circGFRA1和anti-miR-NC转染至SiHa细胞，记为si-circGFRA1+anti-miR-NC组；将si-circGFRA1和anti-miR-138-5p转染至SiHa细胞，记为si-circGFRA1+anti-miR-138-5p组。

1.3 qRT-PCR检测circGFRA1、miR-138-5p的表达水平

采用Trizol试剂提取宫颈癌组织、癌旁组织及SiHa细胞内总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度与纯度。反转录合成cDNA，并进行PCR扩增反应，反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正、反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O补足至20 μL。反应条件：95℃ 5 min、95℃ 30 s、60℃ 30 s、7℃ 30 s，共循环40次。circGFRA1的内参为GAPDH，miR-138-5p的内参为U6，采用2-ΔΔCt法分别计算circGFRA1、miR-138-5p相对表达量。

1.4 双荧光素酶报告实验检测circGFRA1与miR-138-5p的靶向关系

预测circGFRA1与miR-138-5p存在结合位点，将结合位点、突变位点克隆至pmirGLO载体，得到野生型载体wt-circGFRA1、突变型载体mut-circGFRA1，将miR-NC、miR-138-5p mimics分别与wt-circGFRA1、mut-circGFRA1共转染至SiHa细胞，培养48 h后，收集转染细胞，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。采用“1.2”方法将si-NC、si-circGFRA1分别转染至SiHa细胞，培养48 h后，采用qRT-PCR法检测细胞miR-138-5p相对表达量。

1.5 MTT检测细胞增殖

收集各组SiHa细胞并接种于96孔板，1×103个/孔，每孔加20 μL MTT溶液，于培养箱中培养4 h，4 h后丢弃培养液，加入二甲基亚砜(150 μL/孔)，采用酶标仪检测各孔吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率=[(对照组A值-实验组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%]。

1.6 平板克隆形成实验

将各组SiHa细胞接种于6孔板，500个/孔，接种后培养14 d，14 d后丢弃培养液，用PBS溶液冲洗，甲醇固定细胞20 min，结晶紫染色15 min，显微镜下观察克隆形成数。

1.7 Transwell实验检测细胞迁移及侵袭

迁移实验：收集各组SiHa细胞加入小室的上室，1×105个/孔，下室加入500 μL培养液(20%胎牛血清)，进行48 h培养，用多聚甲醛进行固定20 min，固定完毕后采用PBS溶液冲洗，0.1%结晶紫染液染色10 min，显微镜下观察细胞并计算穿过小室的细胞数。侵袭实验：将Matrigel基质胶按一定比例稀释后，每孔45 μL加入小室的上室，37℃凝固2 h，收集各组SiHa细胞加入小室的上室，1×105个/孔，后续实验步骤同迁移实验。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡率

将各组SiHa细胞使用0.25%胰蛋白酶进行细胞消化，3000 r/min离心6 min(离心半径15 cm)，弃上清液，加入500 μL提前预冷的PBS缓冲液重悬细胞，再依次加入Annexin Ⅴ-FITC与PI各5 μL，混匀后静置10 min，采用FACS Calibur流式细胞仪及Cellauest软件检测细胞凋亡情况。

1.9 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达量

采用RIPA裂解液提取SiHa细胞的总蛋白，BCA法测定其浓度。将40 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，4℃加入按比例稀释好的Bax、Bcl-2一抗与内参GAPDH抗体，24 h后室温加入二抗稀释液，1 h后滴加ECL显影，采用Image J软件分析条带灰度值，计算Bax、Bcl-2蛋白的相对表达。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 circGFRA1、miR-138-5p在宫颈癌中的表达

与癌旁组织比较，宫颈癌组织中circGFRA1的表达量升高(P<0.05)，miR-138-5p的表达量降低(P<0.05)，见图1。

A：宫颈癌中circGFRA1高表达；B：宫颈癌中miR-138-5p低表达；与癌旁组织比较，*P<0.05图1 宫颈癌中circGFRA1、miR-138-5p表达的检测Fig.1 Detection of circGFRA1 and miR-138-5p in cervical cancer tissues

2.2 circGFRA1靶向调控miR-138-5p

circGFRA1和miR-138-5p存在结合位点，见图2A。miR-138-5p高表达对wt-circGFRA1的荧光素酶活性产生抑制作用(P<0.05)，对mut-circGFRA1荧光素酶活性无明显影响，见图2B。

与其在si-NC组的表达相比较，si-circGFRA1组miR-138-5p的表达量显著升高(P<0.05)，见图2C。

A：circGFRA1和miR-138-5p的互补序列；B：双荧光素酶报告实验；C：circGFRA1调控miR-138-5p的表达；与miR-NC组比较，*P<0.05；与si-NC组比较，#P<0.05图2 circGFRA1靶向调控miR-138-5pFig.2 Targeted regulation of miR-138-5p by circGFRA1

2.3 circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

与si-NC组比较，si-circGFRA1组细胞增殖抑制率升高(P<0.05)，细胞克隆形成数减少(P<0.05)；与si-circGFRA1+anti-miR-NC组比较，si-circGFRA1+anti-miR-138-5p组细胞增殖抑制率降低(P<0.05)，细胞克隆形成数增多(P<0.05)，见图3、表1。

图3 circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞克隆形成的影响Fig.3 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on the colony formation of SiHa cells

表1 circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响Table 1 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on proliferation of SiHa

2.4 circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭的影响

与si-NC组比较，si-circGFRA1组迁移及侵袭细胞数减少(均P<0.05)；与si-circGFRA1+anti-miR-NC组比较，si-circGFRA1+anti-miR-138-5p组迁移及侵袭细胞数增多(均P<0.05)，见图4、表2。

图4 circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭的影响Fig.4 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on migration and invasion of SiHa cells

表2 circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭的影响Table 2 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on migration and invasion of SiHa

2.5 circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响

与si-NC组比较，si-circGFRA1组细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(均P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；与si-circGFRA1+anti-miR-NC组比较，si-circGFRA1+anti-miR-138-5p组细胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(均P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，见图5、表3。

1：si-NC；2：si-circGFRA1；3：si-circGFRA1+anti-miR-NC；4：si-circGFRA1+anti-miR-138-5p；A：circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞凋亡率的影响；B：circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞凋亡相关蛋白表达的检测图5 circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on apoptosis of SiHa cells

表3 circGFRA1和miR-138-5p对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响Table 3 Effect of circGFRA1 and miR-138-5p on apoptosis of SiHa

3 讨论

circRNA作为一种新型的非编码RNA，通过典型的3′，5′-磷酸二酯键具有稳定的闭环结构。虽然circRNA被认为是RNA的异常剪接产物，但越来越多的证据表明circRNA参与各种生物学过程，例如circRNA可竞争性地结合miRNA，从而参与多种恶性肿瘤的发生发展过程。circRNA具有多个miRNA的结合位点，即circRNA可通过调控多个miRNA调节多种恶性肿瘤细胞的生物学行为[7-9]。circGFRA1是最近发现的与多种恶性肿瘤相关的circRNA，并在多种恶性肿瘤中呈高表达，如circGFRA1在三阴性乳腺癌中表达上调，并可促进三阴性乳腺癌细胞生长及转移，下调的circGFRA1可通过调节miR-361-5p表达抑制三阴性乳腺癌对紫杉醇的耐药性[10-11]。研究显示，circGFRA1在恶性肝细胞癌中表达水平显著升高，并作为miR-149的海绵分子而促进肝细胞癌细胞血管生成、细胞增殖及迁移[12]；circGFRA1在卵巢癌组织和细胞中表达水平升高，并可促进卵巢癌细胞增殖[13]；还有研究结果发现，circGFRA1可充当miR-188-3p的海绵分子而促进非小细胞肺癌发展进程[14]。本研究结果显示，在宫颈癌组织中circGFRA1表达量升高，干扰circGFRA1表达可增加宫颈癌细胞抑制率，减少克隆数、迁移和侵袭细胞数，提示干扰circGFRA1可抑制宫颈癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭。Bcl-2与Bax定位于线粒体基质中，当细胞受到信号刺激后会转移至线粒体外膜，Bax可通过增强线粒体外膜的通透性，此时跨膜电压下降，线粒体中细胞色素等蛋白质被释放从而促进细胞凋亡[15]。本研究结果显示，干扰circGFRA1表达后宫颈癌细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平显著降低，提示干扰circGFRA1表达可促进宫颈癌细胞凋亡。类似的研究亦显示，干扰circGFRA1表达可降低神经胶质瘤U251细胞的活力、集落形成、增殖和迁移潜力[5]。

miR-138在脊椎动物中多为高度保守，miR-138-5p属于miR-138家族成员，位于染色体Xq38.13，研究显示，miR-138-5p不仅在帕金森病、椎间盘蜕变过程中发挥作用，在恶性肿瘤组织中也呈异常表达[16]。研究显示，miR-138-5p在宫颈癌细胞中表达下调，过表达miR-138-5p可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力[17-18]。miR-138-5p通过靶向调控foxc1表达而有效抑制前列腺癌细胞生长和转移[19]。本研究结果显示，宫颈癌组织和细胞中miR-138-5p的表达量降低，circGFRA1可靶向结合miR-138-5p，抑制miR-138-5p表达的同时还能逆转干扰circGFRA1对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。通过双荧光素酶报告实验进一步证实circGFRA1与miR-138-5p存在靶向关系。以上结果提示，一方面，circGFRA1可靶向结合miR-138-5p，影响宫颈癌发生发展，miR-138-5p有望成为宫颈癌诊治的潜在标记物；另一方面，circGFRA1可能作为宫颈癌治疗的新的潜在重要靶点。

综上所述，circGFRA1在宫颈癌高表达，干扰circGFRA1能抑制宫颈癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭，并对细胞凋亡具有促进作用，可能与调控miR-138-5p有关，circGFRA1可能作为宫颈癌治疗的潜在重要靶点，具体作用机制尚需进一步探究。