野芋提取物通过SFTA1P对肝癌细胞生物学行为的影响*

陈晓青， 袁发浒 ， 黄 丹， 邱文洪

江汉大学医学院 1医学实验中心 2基础医学部，武汉 430056

肝癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤。目前传统中药由于药性温和，不良反应较少，还可提高机体的免疫力，成为治疗肿瘤的重要方法之一[1]。研究报道地榆乙酸乙酯提取物可抑制肝癌HepG2细胞增殖，促进细胞凋亡[2]。南蛇藤提取物可抑制肝癌细胞的增殖与侵袭转移[3]。研究报道野芋提取物具有抗肿瘤作用[4]，但其是否具有抗肝癌的作用及其机制尚不清楚。研究报道显示，lncRNA与肿瘤的进展相关，表面活性剂有关的1假基因(surfactant associated 1 pseudogene，SFTA1P)是一种lncRNA，在肺癌中异常表达[5]。SFTA1P在胃癌患者组织中低表达，与肿瘤大小、淋巴结转移和患者的预后密切相关；SFTA1P过表达可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。但SFTA1P对肝癌细胞生物行为的影响尚未可知，本实验旨在研究野芋提取物对肝癌细胞生物行为的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

肝癌细胞系HCC9204购自上海宾穗生物科技有限公司；野芋药材购自宝芝林大药房；胎牛血清、RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司；细胞计数试剂盒8(CCK-8)购自武汉维克赛思科技有限公司；RIPA蛋白裂解液购自上海羽朵生物科技有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；Trizol试剂、荧光定量试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；Transwell小室购于美国BD公司。

1.2 野芋提取物的制备

取适量野芋干燥药材，粉碎后用体积浓度为80%的乙醇浸泡(乙醇与野芋用量比为2 mL∶1 g)，在37℃条件下提取2 h，提取3次，减压浓缩去除提取液中的乙醇，得到浸膏，将浸膏用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯与浸膏的重量比为1 mL∶1 g；萃取3次，将萃取液减压浓缩后去除乙酸乙酯，得到萃取物即为野芋提取物，将其稀释至所需浓度备用。

1.3 细胞处理与分组

HCC9204细胞用RPMI-1640培养液常规培养，用浓度分别为5、10、15、20 mg/L的野芋提取物处理HCC9204细胞，作为野芋提取物低剂量、中剂量、中高剂量、高剂量组；正常培养的肝癌HCC9204细胞作为对照组。将pcDNA3.1、pcDNA3.1-SFTA1P转染至HCC9204细胞中，记为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-SFTA1P组；将si-NC、si-SFTA1P转染至HCC9204细胞后用20 mg/L的野芋提取物处理，记为野芋提取物+si-NC组、野芋提取物+si-SFTA1P组。

1.4 CCK-8检测细胞存活率

取各组细胞，加入CCK-8试剂后孵育2 h，然后用酶标仪检测490 nm处吸光度(A)值。细胞存活率(%)为实验组和对照组A值的比值。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

取各组细胞，按试剂盒说明加入相应剂量的Annexin Ⅴ-FITC和PI，混匀后避光孵育10 min；上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 克隆形成实验检测细胞增殖

取各组细胞，消化后悬浮细胞，分别按每孔100个细胞接种于6孔板中，大约培养2周，有肉眼可见克隆时停止培养，然后用甲醇固定细胞，再用吉姆萨染色，计数>50个细胞的集落。

1.7 蛋白质印迹(Western blot)法检测Ki-67、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达

提取细胞总蛋白，并进行定量；然后进行SDS-PAGE电泳，再转至PVDF膜上，用5%的牛血清蛋白封闭1 h；加入一抗4℃过夜，加入二抗室温培养1 h，再用TBST洗涤3次，加入化学发光试剂显影，成像后用Image J分析蛋白条带的灰度水平，以GAPDH为内参计算蛋白表达水平。

1.8 Transwell检测细胞迁移

将200 μL细胞悬液加入Transwell小室的上室，培养24 h后先用多聚甲醛固定，再用结晶紫染色，然后在显微镜下观察计数。

1.9 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SFTA1P和miR-665的表达水平

提取总RNA，合成cDNA后按说明书操作进行PCR检测，最终相对表达量用2-ΔΔCt法计算。以GAPDH和U6为内参，SFTA1P上游引物序列：5′-CAGCATTCCAGGTGGGCTTT-3′，下游引物序列：5′-CCTTGTTTGGCTTACTCGTGC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-GGGAGGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物序列：5′-GAGTCCTTCCAC-GATACCAA-3′；miR-665上游引物序列：5′-ACCAGGAGGCTGAGG-3′，下游引物序列：5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.10 双荧光素酶报告实验检测SFTA1P对miR-665的靶向调控

构建含miR-665结合位点的SFTA1P的荧光素酶表达载体WT-SFTA1P和MUT-SFTA1P，将其分别与miR-NC和miR-665共转染至HCC9204细胞中。按照试剂盒说明书检测荧光素酶活性。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 野芋提取物对HCC9204增殖、凋亡、迁移的影响

与对照组比较，野芋提取物各剂量组HCC9204细胞的存活率显著降低，凋亡率显著升高，克隆形成数和迁移细胞数显著减少，Ki-67、N-cadherin、Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax、E-cadherin蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)(图1、表1)。

A：野芋提取物对HCC9204凋亡的影响；B：野芋提取物对HCC9204迁移的影响(结晶紫染色，×200);C：野芋提取物对HCC9204中相关蛋白表达的影响;1：对照组；2：野芋提取物低剂量组；3：野芋提取物中剂量组；4：野芋提取物中高剂量组；5：野芋提取物高剂量组图1 野芋提取物对HCC9204凋亡、迁移及相关蛋白表达的影响Fig.1 The effect of Colocasia Antiquorum extract on apoptosis and migration of HCC9204 and expression of related proteins

表1 野芋提取物对HCC9204增殖、凋亡、迁移的影响Table 1 Effect of Colocasia Antiquorum extract on proliferation and apoptosis of

2.2 野芋提取物对HCC9204中SFTA1P表达的影响

与对照组比较，野芋提取物各剂量组SFTA1P表达水平显著升高(均P<0.05)(图2)。

与对照组比较，*P<0.05图2 野芋提取物对HCC9204中SFTA1P表达的影响Fig.2 Effect of Colocasia Antiquorum extract on expression of SFTA1P in HCC9204

2.3 SFTA1P对HCC9204增殖、凋亡及迁移的影响

与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-SFTA1P组SFTA1P表达水平显著升高，细胞存活率显著降低，凋亡率显著升高，克隆形成数和迁移细胞数显著减少，Ki67、N-cadherin、Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax、E-cadherin蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)(图3、表2)。

A：SFTA1P对HCC9204凋亡的影响；B：SFTA1P对HCC9204迁移的影响(结晶紫染色，×200)；C：SFTA1P对HCC9204中相关蛋白表达的影响；1：pcDNA3.1组；2：pcDNA3.1-SFTA1P组图3 SFTA1P对HCC9204凋亡、迁移及相关蛋白表达的影响Fig.3 The effect of SFTA1P on apoptosis and migration of HCC9204 and expression of related proteins

表2 SFTA1P对HCC9204增殖、凋亡及迁移的影响Table 2 Effects of SFTA1P on the proliferation and apoptosis of

2.4 SFTA1P靶向miR-665

Starbase预测显示SFTA1P与miR-665存在结合位点(图4)。与miR-NC组相比，miR-665组中WT-SFTA1P荧光素酶活性显著降低[(1.00±0.07)vs.(0.18±0.02)，P<0.05]；而MUT-SFTA1P荧光素酶活性无显著差异[(0.99±0.07)vs.(1.02±0.07)，P>0.05]。与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-SFTA1P组中miR-665表达水平显著降低[(0.98±0.05)vs.(0.28±0.03)，P<0.05]。

图4 SFTA1P靶向调控miR-665Fig.4 Targeted regulation of miR-665 by SFTA1P

2.5 抑制SFTA1P对野芋提取物处理的HCC9204增殖、凋亡、迁移的影响

与野芋提取物+si-NC组相比，野芋提取物+si-SFTA1P组SFTA1P表达水平显著降低，存活率显著升高，凋亡率显著降低，克隆形成数和迁移细胞数显著增加，Ki67、N-cadherin、Bcl-2蛋白表达水平显著升高，Bax、E-cadherin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)(图5、表3)。

A：抑制SFTA1P对野芋提取物处理的HCC9204凋亡的影响；B：抑制SFTA1P对野芋提取物处理的HCC9204迁移的影响(结晶紫染色，×200)；C：抑制SFTA1P对野芋提取物处理的HCC9204相关蛋白表达的影响；1：野芋提取物+si-NC组；2：野芋提取物+si-SFTA1P组图5 抑制SFTA1P对野芋提取物处理的HCC9204凋亡、迁移及相关蛋白表达的影响Fig.5 The effect of inhibition of SFTA1P on the apoptosis，migration and related protein expression of HCC9204 treated with Colocasia Antiquorum extract

表3 抑制SFTA1P对野芋提取物处理的HCC9204增殖、凋亡及迁移的影响Table 3 The effect of inhibition of SFTA1P on the proliferation，apoptosis and migration of HCC9204 treated with Colocasia Antiquorum

3 讨论

中医药在肿瘤预防和治疗过程中具有明显的效果，因为毒副作用较小，对防治肝癌复发、转移及延长生存期有一定的帮助，对肝癌治疗有重要价值[7-8]。研究报道，预知子种子提取物能抑制HepG2肝癌细胞的增殖及迁移[9]。半枝莲提取物可抑制肝癌HepG2细胞迁移及侵袭[10]。此外，已有研究证实野芋提取物具有抗肿瘤活性[4]。本实验为研究野芋提取物对肝癌细胞的影响，用不同浓度的野芋提取物处理肝癌细胞HCC9204，结果显示，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，克隆形成数、迁移细胞数显著减少，Ki-67、N-cadherin、Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax、E-cadherin蛋白表达水平显著升高，呈剂量依赖性。说明野芋提取物可抑制肝癌细胞增殖、迁移，并促进肝癌细胞凋亡。

研究表明，lncRNA参与多种肿瘤的发生、发展及预后，也与肝癌密切相关[11]。研究报道SFTA1P与肺鳞状细胞癌预后相关[12]；SFTA1P在肺鳞状细胞癌中低表达，上调其表达可促进肺鳞状细胞癌细胞凋亡，并增强对顺铂的敏感性[13]。SFTA1P在肺腺癌表达下调，上调其表达可抑制肺腺癌细胞迁移和侵袭[14]。经TCGA数据库分析，SFTA1P在肝细胞癌组织中呈现高表达[15]。因此，我们猜测SFTA1P异常表达与肝癌发展进程有关。我们的实验结果与上述研究一致，在肝癌细胞中，过表达SFTA1P导致细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，克隆形成数、迁移细胞数显著减少，Ki-67、N-cadherin、Bcl-2蛋白表达水平显著降低，Bax、E-cadherin蛋白表达水平显著升高。表明过表达SFTA1P可抑制肝癌HCC9204细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡。研究发现中医药提取物可通过调控lncRNA介导的通路而发挥抑癌作用。如槐耳提取物可通过调控H-19/miR-675-5p通路从而减缓乳腺癌进展[16]；蒲公英根提取物可抑制胃癌细胞增殖和迁移，其机制可能与靶向lncRNA CCAT1有关[17]。因此，我们深入探究野芋提取物是否通过介导SFTA1P表达从而影响肝癌进展。进一步实验结果显示，野芋提取物处理的肝癌HCC9204细胞中SFTA1P表达水平显著升高，而抑制SFTA1P表达可逆转野芋提取物对HCC9204细胞增殖、迁移和凋亡的影响。说明野芋提取物可调控SFTA1P的表达，其可能通过SFTA1P影响肝癌细胞的进展。

多项证据表明，lncRNA可通过靶向miRNA参与肝细胞癌的发生及发展[18]。此外，有研究表明肝癌患者血清中外泌体miR-665水平升高，与肝癌进展相关，miR-665的水平可能有助于肝癌的临床诊断和预后判断[19]。miR-665通过靶向B型酪氨酸磷酸酶受体(tyrosine phosphatase receptor type B，PTPRB)减少Hippo信号传导，从而促进肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖[20]。说明miR-665参与肝癌的发生发展过程。且Sun等[21]研究揭示，lncRNA LIMT可通过吸附miR-665从而促进肝癌细胞索拉菲尼耐药性及上皮间质转化进程。本实验结果同样显示，SFTA1P可在肝癌细胞中与miR-665靶向结合，且双荧光素酶报告实验表明SFTA1P可靶向调控miR-665的表达。提示SFTA1P可能通过调控miR-665的表达影响肝癌细胞的进展。

综上所述，野芋提取物可通过调控SFTA1P/ miR-665轴抑制肝癌HCC9204细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡。