血管内皮聚集受体-1 rs12041331位点多态性对初发脑梗死病人认知功能的影响

郭宏伟，胡义奎，刘涛生，谭龙君，刘迪龑，冯 琼

脑卒中后认知功能障碍是指脑卒中后6个月内出现的各种类型和程度的认知功能障碍，其危险因素包括脑卒中反复发作、高龄及受教育程度低等[1]。有研究表明， 血小板内皮聚集受体-1(PEAR1)基因(rs12041331)纯合突变不仅影响抗血小板药物疗效，并且与脑卒中反复发作有关[2]。为排除脑卒中反复发作对病人认知功能损害的影响，本研究选取初发脑梗死病人为研究对象，旨在分析PEAR1 基因(rs12041331)纯合突变与认知功能障碍的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2019年1月—2020年1月在武汉市武昌医院神经内科门诊或住院治疗的初发脑梗死病人150例。所有病人均符合第四届全国脑血管病学术会议诊断标准[3]，且经我院颅脑计算机断层扫描或磁共振成像检查确诊为脑梗死。排除标准：短暂性脑缺血发作、小卒中病人；严重精神障碍或严重器官功能衰竭病人。所有病人均自愿参与本研究并签署知情同意书。本研究得到武汉市武昌医院伦理道德委员会的批准。根据发病后6个月内7次(入组时及每个月1次)简易智力状态检查量表(Mini-mental State Examination，MMSE)评分[4]最高分将病人分为认知功能正常组(112例)和认知功能障碍组(38例)。

1.2 观察指标

1.2.1 临床资料 记录病人临床资料。测量身高和体重并计算体质指数。高血压：收缩压≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒张压≥90 mmHg，或既往曾诊断为高血压，或正服用降压药物治疗的病人。糖尿病：空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或/和糖耐量试验测定餐后2 h血糖(2 hPBG)≥11.1 mmol/L，或正在接受降糖治疗的病人。吸烟：几乎每日吸烟，且每日平均吸烟≥1支，持续时间>1年。饮酒：几乎每日饮酒，且每日饮酒≥50 g，持续时间>1年。高龄：年龄>75岁。低教育程度：中学以下文化程度或未接受过任何教育。统计两组入院时美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分[5]，评分越高提示病人神经功能缺损越严重。

1.2.2 PEAR1基因(rs12041331)单核苷酸多态性测定 所有病人入组后次日清晨抽取空腹肘静脉血3 mL，使用乙二胺四乙酸(EDTA)管抗凝处理，保存于-20 ℃冰箱中，按照DNA提取试剂盒(Tiangen)说明书进行规范操作提取DNA，保存在-20 ℃冰箱中备用。采用聚合酶链反应(PCR)-限制性酶切片段长度多态性技术(RFLP)及直接PCR测序法检测基因型。PCR反应系统：2 μL基因组DNA，正向和反向各5 μL 2×Taq Mix 12.5 μL引物(Aidlab Biotechnologies Co，Ltd)，将0.5 μL超纯净化水加入25 μL体系中。PCR在此项检测中的扩充条件：94.0 ℃预变性3 min，94.0 ℃变性30 s，58.5 ℃、59.5 ℃及72 ℃各变性30 s，72.0 ℃扩增 5 min，扩增后再用2%琼脂糖进行凝胶电泳，PCR扩增产物使用凝胶成像检测，rs12041331反向引物为5′-GCCCTCTCAGCCTCCGAGC-3′，正向引物为5′-CACTAATCTTATCCCCATTTTCTAGGTG-3′，将退火温度设置为59.5 ℃，进行30次循环，内切酶为BCCI，酶切片段大小：AA分别为178 bp和230 bp；AG分别为408 bp、178 bp及230 bp；GG为408 bp。取2 μL上述扩增产物，1 μL内切酶，2 μL的IOxNEB buffe，5 μL无菌双蒸水，建立10 μL反应体系。37 ℃条件下，至少进行1 h酶切反应，之后终止。反应终产物与2%琼脂糖一起制成凝胶，采用Gelred核酸染色，在140 V电压和300 mA电流下，进行电泳，40 min后将该系统进行成像，观察最终结果并拍照。PCR引物制作和受试者DNA测序交由上海生工生物工程股份有限公司操作。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 认知功能障碍组高龄、低教育程度、吸烟、糖尿病比例及LDL-C水平高于认知功能正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2 两组PEAR1 rs12041331位点多态性分布比较 认知功能障碍组野生型GG频率低于认知功能正常组，纯合突变型AA频率高于认知功能正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表2。

表2 两组PEAR1 rs12041331位点多态性分布比较 单位：例(%)

2.3 初发脑梗死病人发生认知功能障碍的Logistic多因素回归分析 以初发脑梗死病人是否发生认知功能障碍作为因变量，以高龄、低教育程度、吸烟、糖尿病、LDL-C、PEAR1 rs12041331纯合突变型(AA)为自变量，进行多因素Logistic回归分析，结果显示：PEAR1 rs12041331纯合突变型(AA)、高龄、低教育程度、糖尿病与初发脑梗死病人认知功能障碍有关(P<0.01)。详见表3。

表3 初发脑梗死病人发生认知功能障碍的Logistic多因素回归分析

3 讨 论

PEAR1是一种与巨核细胞生成及血小板活化有关的跨膜受体，其表达受DNA甲基化驱动，在血小板和内皮细胞中表达最多。PEAR1基因位于人类染色体1q23.1，包括22个内含子及23个外显子，长度约30 kb。有研究显示，PEAR1多个单核苷酸多态性位点与血管内皮功能和血小板活化等密切相关[6]，不同的PEAR1基因位点变化可能影响血小板的反应性。

正常情况下，PEAR1在人体外周血液血小板表面表达水平较低，在二磷酸腺苷、胶原相关多肽及其他应激情况下，PEAR1酪氨酸磷酸化和膜表达均增加，导致血小板膜糖蛋白(GP)Ⅲa和GPⅡb结合，成为与纤维蛋白原特异性结合受体，后者与纤维蛋白原结合是引起血小板聚集的最终共同路径，进而参与血栓形成[7]。有研究显示，PEAR1基因与脑卒中和冠心病之间的关系，可能与其影响血小板激活，延缓巨核祖细胞增殖、分化等有关[8]。有研究显示，PEAR1基因多态性可能与冠心病病人发生阿司匹林抵抗有关，其中AA型病人对阿司匹林抵抗最为严重[9]。陈静静等[10]研究表明，PEAR1基因rs12041331(GA+AA)是阿司匹林抵抗的独立影响因素(P<0.05)，PEAR1基因rs12041331位点A等位基因与缺血性脑卒中病人发生阿司匹林抵抗有关。

PEAR1单核苷酸多态性位点与人体血小板的功能和反应有关，因此相关研究报道较多，单核苷酸多态性位点研究主要集中在rs12401331、rs4661012、rs9550270、rs11264579、rs1273215、rs1256688、rs3737224，其中rs12041331研究较多。Keramati等[11]研究显示，通过基因测序发现PEAR1的532个变体中，内含子1变体rs12041331与所有受试者血小板聚集表型均相关，全基因组关联分析结果显示，与血小板聚集相关的内含子1变体是rs12041331。

Pi等[12]研究显示，PEAR1单核苷酸多态性位点，特别是rs12041331、rs12566888，与心血管疾病的发生有关。PEAR1的单核苷酸多态性尽管与川崎病易患性无关，但rs12041331多态性可增加川崎病与冠状动脉瘤的形成风险。Faraday等[13]研究显示，PEAR1 rs12041331基因内含子变异影响相关蛋白的表达，而相关蛋白与血小板聚集相关的多种激动剂触发和功能变异有关。

相关研究显示，PEAR1 rs12041331 基因多态性与血小板功能及抗血小板药物的疗效有关[14]。有研究显示，PEAR1 rs12041331与阿司匹林血小板聚集改变和心血管事件风险增加有关[15]。石秀锦等[16]研究显示，我国人群PEAR1 rs12041331野生G基因频率为0.61，突变A基因频率为0.39，PEAR1单核苷酸多态性位点与病人血小板活性增高有关，突变型AG、AA血小板聚集率高于野生型GG，使用抗血小板聚集药物(阿司匹林和/或氯吡格雷)情况下，突变型AG心血管事件发生率增高。李建设等[17]在114例初诊脑梗死病人中发现3种PEAR1 rs12041331基因表型，其中野生型GG占50.9%，杂合突变型GA占42.1%，纯合突变型AA占7.8%，突变型AG、AA即使长期坚持服用阿司匹林，病人脑梗死患病和复发概率均增加，除外吸烟、年龄、糖尿病、高水平LDL-C、其中PEAR1基因纯合突变与脑梗死复发的相关性最强。

脑卒中具有高发病率、高复发率、高致残率及高致死率的特点，是全球残疾和致死的主要疾病之一[18]。脑卒中导致病人肢体和生活能力降低，但认知功能障碍起病隐匿，轻度认知功能障碍若未干预，极易错过最佳恢复时机，给病人、家庭及社会带来沉重的负担[19]。

认知功能减退是急性脑卒中病人常见的临床表现之一，包括认知障碍非痴呆至痴呆不同程度的认知障碍，该病发生机制尚未明确，导致早期诊断及治疗困难，部分早期认知障碍非痴呆经过积极治疗，可延缓疾病进程，若发展到痴呆阶段，病人病情多表现为阶梯式加重，病程呈波动性，治疗难度加大。认知功能减退不但影响病人社会适应及日常生活能力，同时影响综合康复治疗与二级预防，主要危险因素包括高龄、低教育程度、复发性脑卒中等[20]。早期认识、预防和治疗痴呆的相关危险因素可提高病人生活质量并减轻社会负担，应引起临床医生广泛重视，做到早期评估、早期预防。

目前，MMSE是国内外应用广泛的认知筛查量表，该量表共30道题(回答正确得1分，回答错误或不知道得0分)，总分0～30分，包含以下7方面：时间定向力、地点定向力、即刻记忆、注意力及计算力、延迟记忆、语言和视空间。MMSE评分与文化水平密切相关，文盲>17分，小学>20分，初中及以上>24分[21]。曹辉等[22]研究显示，MMSE可作为多发腔隙性脑梗死早期认知功能诊断的参考标准。

本研究单因素分析结果显示，认知功能障碍组高龄、低教育程度、吸烟、糖尿病比例和LDL-C水平高于认知功能正常组(P<0.05)。因此，干预常规危险因素，保持积极的学习和良好的生活方式，可有效控制代谢异常，可能降低认知功能障碍发生率。同时本研究结果显示，认知功能障碍组野生型GG频率低于认知功能正常组，纯合突变型AA频率高于认知功能正常组(P<0.01)，提示PEAR1基因多态性可能与认知功能障碍密切相关。多因素Logistic回归分析结果显示，PEAR1 基因 rs12041331纯合突变(AA)、高龄、低教育程度、糖尿病与初发脑梗死病人认知功障碍的发生有关(P<0.001)。

PEAR1基因纯合突变可增加复发风险，加速病人认知功能障碍的进程，且PEAR1基因纯合突变影响抗血小板药物活性和疗效。基础研究显示，PEAR1除了在血小板和内皮细胞中高度表达外，同时发现其在卫星神经胶质前体细胞中表达，卫星神经胶质前体细胞与神经元细胞凋亡有关，进一步提示PEAR1可能与认知功能障碍病理生理有关[23]。因此，PEAR1的基因型分布可能与认知功能减退有关，病人年龄、低教育程度、吸烟、血糖、LDL-C水平及PEAR1 rs12041331位点(AA)均是初发脑梗死病人认知功障碍的独立影响因素。

由于PEAR1基因多态性影响血小板功能和血小板聚集过程，因此PEAR1可作为影响脑血管疾病病人疗效的必要因素。PEAR1多态性可能是脑梗死病人的一个危险因素，且PEAR1基因纯合突变也可能是初发脑梗死病人认知功障碍的独立危险因素，因此，通过基因检测和PEAR1多态性评估管病人有助于改善疗效，具体机制需进一步深入研究。

综上所述，评估PEAR1基因多态性对预测初发脑梗死病人认知功障碍有一定的作用，初出发脑梗死病人应积极寻找认知障碍的危险因素，以便合理应用相关药物，加强病人的综合管理，对改善预后、提高生活质量具有重要的意义。PEAR1有多个基因多态性位点，在我国人群中均有分布，且存在一定的种族差异。本研究中研究对象局限，今后应进行涉及多个族群或群体，大样本量和多个基因位点的研究，分析脑梗死病人认知功障碍的相关因素。