P2Y12、GPⅢa基因多态性与冠心病病人PCI术后氯吡格雷抵抗程度的关系探讨

霍鸿波，王 琳，胡樑臣

氯吡格雷是抗血小板聚集药物的一种，被广泛用于改善人体血凝状态、减少血栓等治疗中，其在冠心病经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)术后抗血栓疗效也被临床广泛肯定[1]。但大量研究发现，PCI术后病人的氯吡格雷疗效往往因个体差异而出现巨大差别，部分病人即便严格按照医嘱服药依然无法避免心血管血栓、支架内再狭窄等并发症的发生，临床将这一现象命名为氯吡格雷抵抗[2-3]。随着医学界的进一步研究发现，氯吡格雷疗效受病人年龄、既往病史、药物相互作用以及基因多态性等因素影响[4]。血小板ADP受体亚基12(P2Y12)是血小板膜表面上的一种二磷酸腺苷受体，是氯吡格雷的主要活性作用靶，可与氯吡格雷不可逆结合，并抑制腺苷酸环化酶表达，最终抑制血小板聚集。P2Y12基因多态性可直接影响氯吡格雷的疗效[5]。血小板糖蛋白Ⅲa(GPⅢa)则是血小板激活的重要通道，已有研究显示，GPⅢa具有很高多态性，其中外显子2第1 565位核苷酸突变研究最为深入，该位点决定了人PLA1及PLA2基因，而心血管疾病病人PLA2突变率高达30%以上。本研究旨在探讨P2Y12、GPⅢa基因多态性与冠心病病人PCI术后氯吡格雷抵抗的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月—2020年4月在我院治疗的冠心病病人300例，其中，男175例，女125例；年龄<60岁164例，≥60岁136例。纳入标准：①符合《中国经皮冠状动脉介入治疗指南(2016)》[6]制定的标准；②在我院行冠状动脉造影并行PCI治疗，且术后服用氯吡格雷进行抗血小板治疗；③18岁以上汉族病人；④病人及家属知情同意。排除标准：①合并肝、肾、肺等重要脏器疾病、恶性肿瘤、凝血功能疾病等；②入院前6个月有脑卒中、内脏出血性疾病史；③入院前1个月内服用过阿司匹林等药物；④入院前6个月内有手术史者。

1.2 治疗方法 病人均在双联抗血小板治疗基础上加用氯吡格雷，术前给予病人口服75 mg氯吡格雷[赛诺菲(杭州)制药有限公司生产，生产批号：S14202003034]+0.1 g阿司匹林(拜耳医药保健有限公司生产，生产批号：B14202005047)，持续3 d；随后于首日加用300 mg氯吡格雷，之后每天加用75 mg氯吡格雷，持续12个月[7]。

1.3 实验室检查 收集病人术后5 d(氯吡格雷服药5 d)的空腹静脉血3 mL，将150 μL血液样本滴入至含150 μL Lysis Buffer+15 μL蛋白酶K的试管内，于55 ℃条件下进行水浴，时长为10 min。取出后滴入450 μL Binding Buffer，混匀并80 ℃水浴10 min，滴入560 μL NaCl，混匀静置10 min，4 000 r/min，6 cm半径离心10 min，收集上清，滴入50～100 μL Elution Buffer，混匀并80 ℃水浴10 min，轻轻晃动，确保DNA有效洗脱，冷藏备用。在PUBNED上查询P2Y12基因rs4244285及GPⅢa基因PLA位点的基因序列，P2Y12基因rs4244285位点的正向引物序列：5-′CAGAGCTTGGCATATTGTATC-3′，反向引物序列：5-′AAATTGTTTCCAATCATTTAGCT-3′；GPⅢa基因PLA位点正向引物序列：5-′CAGGAGGTAGAAGTCGCCATAG-3′，反向引物序列：5-′TATCCTTCAGCAGATTCTCCTTCA-3′。聚合酶链式反应(PCR)条件如下，P2Y12基因rs4244285 PCR：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环。GPⅢa基因PLA PCR：50 ℃预变性1 min，95 ℃变性10 min，90 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，共45个循环。选用美国ABI公司生产的7700 HT荧光定量PCR仪读取最终结果。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 300例病人中，76例发生氯吡格雷抵抗(观察组)，224例未发生氯吡格雷抵抗(对照组)。观察组年龄≥60岁、总胆固醇(TC)≥6.0 mmol/L的比例明显高于对照组(P<0.05)。详见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2 两组P2Y12基因rs4244285多态性比较 观察组与对照组P2Y12基因rs4244285多态性符合Hardy-Weinberg平衡；观察组P2Y12基因rs4244285位点GA+AA基因型比例和等位基因A比例分别为72.37%和52.63%，明显高于对照组(P<0.05)。详见表2。

表2 两组P2Y12基因rs4244285多态性比较 单位：例(%)

2.3 两组GPⅢa基因多态性比较 观察组与对照组GPⅢa基因多态性符合Hardy-Weinberg平衡。观察组GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2基因型和等位基因PLA2比例分别为50.00%，28.29%，明显高于对照组(P<0.05)。详见表3。

表3 两组GPⅢa基因多态性比较 单位：例(%)

2.4 观察组不同基因多态性病人血小板聚集率降低幅度比较 观察组P2Y12基因rs4244285位点GA+AA基因型病人血小板聚集率降低幅度明显低于GG基因型病人(P<0.05)；观察组GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2基因型病人血小板聚集率降低幅度明显低于PLA1/PLA1基因型病人(P<0.05)。详见表4。

表4 观察组不同基因多态性病人血小板聚集率降低幅度比较(±s) 单位：%

2.5 多因素分析 将临床资料有统计学变量、P2Y12基因rs4244285位点多态性、GPⅢa基因多态性作为自变量，将是否发生氯吡格雷抵抗作为因变量进行Logistic回归分析，结果显示：年龄、TC、P2Y12基因rs4244285位点GA+AA、GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2是冠心病病人PCI术后氯吡格雷抵抗发生的影响因素[OR值分别为1.365，1.409，2.686，2.776，P均<0.001]。详见表5。

表5 Logistic回归分析结果

3 讨 论

氯吡格雷属于噻吩吡啶类药物，本身无生物活性，作用于人体后可与肝脏细胞色素P450酶系统结合而生成具有生物活性的代谢产物，这一代谢产物可抑制血小板膜上的二磷酸腺苷与其受体结合，最终形成抗血小板聚集效应[8-9]。但受个体差异影响，氯吡格雷用药后部分病人血小板功能无法被有效抑制，即出现氯吡格雷抵抗[10]。文献报道，氯吡格雷抵抗发生率为4%～31%[11]。氯吡格雷抵抗诱因多元，如年龄、糖尿病、血小板更新速度等均可导致本现象。本研究中，观察组年龄≥60岁、TC≥6.0 mmol/L的比例均明显高于对照组，表明高龄、高血脂与氯吡格雷抵抗密切相关，临床需加强对高龄及高血脂冠心病病人的用药管理，积极观察病人是否有氯吡格雷抵抗现象，并合理调整药物，避免医疗资源的浪费。近年来，研究显示，基因多样性也是氯吡格雷抵抗现象出现的重要诱因[12]。P2Y12作为氯吡格雷的作用靶点，其基因多态性被临床广泛认为与氯吡格雷抵抗有关[13]。本组研究中，观察组P2Y12基因rs4244285位点GA+AA基因型比例和等位基因A比例均明显高于对照组，同时GA+AA基因型病人血小板聚集率降低幅度明显低于GG基因型病人，可以发现P2Y12基因rs4244285位点A等位基因突变病人更易出现氯吡格雷抵抗现象，其原因可能与这种突变将导致P2Y12受体蛋白氨基酸中的磷酸腺苷脱氨酶改变，并影响P2Y12受体结构，最终影响P2Y12受体的活化，抑制氯吡格雷的抗血小板聚集作用。有研究将P2Y12受体上的6个位点组成6个单倍型后，发现单倍型F(rs6787801位点已突变成胞嘧啶C，其余位点为原生状态)的病人血小板聚集率较单倍型A(rs6787801及rs6801273位点已突变)病人更低，这一定程度上佐证了本研究的结论[14-15]。该学者还认为，rs6787801位于P2Y12基因启动子区域，多态性位点变化将可能通过影响P2Y12基因转录活性，来抑制P2Y12受体蛋白翻译，最终引发氯吡格雷抵抗现象，而rs4244285位点同样处于P2Y12受体基因的启动子区域。

GPⅢa基因位于人基因17号q21～22带，多以复合物形成存在，当血小板活化后，GPⅡb/Ⅲa将获得纤维蛋白原结合能力，并以此诱导血小板聚集，进而参与止血及血栓生成[16]。GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原结合是血栓生成的最后步骤，也是抗血小板聚集药物的治疗靶点[17]。PLA1/PLA2是GPⅡb/Ⅲa上发现最早的多态性位点，已有研究显示，PLA2基因型人群冠心病发病率显著高于健康人群[18]。本研究发现，观察组GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2基因型和等位基因PLA2比例明显高于对照组，并且GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2基因型病人血小板聚集率降低幅度明显低于PLA1/PLA1基因型病人，这表明GPⅢa基因PLA2多态性与冠心病病人PCI术后氯吡格雷抵抗有关。有研究发现，47岁以前患心肌梗死的病人，50%携带着PLA2等位基因，而年龄相匹配的对照组PLA2携带率仅为25%，提示PLA2等位基因突变与年龄有关，同时还是年轻人发生心肌梗死的影响因素[3]，这也佐证了本研究结论。Logistic回归分析显示：年龄、TC、P2Y12基因rs4244285位点GA+AA、GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2是冠心病病人PCI术后氯吡格雷抵抗发生的影响因素，提示临床需加强对高龄、高血脂以及P2Y12、GPⅢa基因A及PLA2多态性的用药管理工作，观察病人是否有氯吡格雷抵抗现象，并积极应对。

氯吡格雷是临床冠心病防治的常规药物，而我国逐年增高的冠心病发病率将使该药的需求逐年增高，如何合理利用氯吡格雷，避免氯吡格雷抵抗带来的医疗资源浪费及经济负担已成为临床研究的又一重点。而P2Y12、GPⅢa基因多态性筛查工作则可一定程度指导氯吡格雷用药，避免氯吡格雷浪费情况，但现行的P2Y12、GPⅢa基因多态性筛查方法推广难度较大，但这正是需要医务人员努力的方向。