冠心病病人外周血单个核细胞AIM2表达水平及其与炎性因子的相关性

王玉燕，铁虎光，金丽山，马万程

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病，随着饮食结构的改变及生活水平的不断进步，该病发病率和死亡率呈增加趋势，引发的心源性死亡等严重不良预后成为重大的公共问题[1]。冠心病主要包括稳定型心绞痛(stable angina pectoris，SAP)、不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris，UAP)、急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，冠心病是一种慢性炎症性疾病，与肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)等炎性因子均有密切联系[2-3]。黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)是位于细胞质中的一种蛋白质，可间接诱导炎症体组装，进而在炎症反应中发挥着重要作用[4]。本研究旨在分析SAP、UAP、AMI病人外周血单个核细胞AIM2表达水平及其与血浆炎性因子的相关性，以期进一步明确冠心病的发病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年7月—2020年5月于我院住院治疗的221例冠心病病人，将冠心病病人分为SAP组(69例)、UAP组(74例)和AMI组(78例)；同期选取健康体检者79名作为对照组。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：AMI符合急性ST段抬高型心肌梗死诊断及治疗指南[5]，SAP符合慢性稳定型心绞痛诊断与治疗指南中的诊断标准[6]，UAP符合相关诊断标准[7]；病人病例资料齐全；符合伦理学标准，所有研究对象均为自愿参与本研究；近1个月内无手术治疗史。排除标准：伴有感染性疾病、恶性肿瘤；伴有原发性心肌病或严重肝、肾功能不全；6个月内发生过脑卒中及急性脑血管疾病；伴有其他血液系统及自身免疫疾病；近1周内使用免疫抑制剂、抗炎药物。

1.3 观察指标 查阅门诊及住院病历，收集病人入院时临床资料，包括性别、年龄、体质指数(body mass index，BMI)、吸烟史、高血压、糖尿病、三酰甘油(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、血糖水平。

1.4 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒(货号：YT9197)、反转录试剂盒(货号：YT9036)购自北京伊塔生物科技有限公司；SYBR®Green Master Mix(货号：11202ES)购自上海翊圣生物科技有限公司；TNF-α酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(货号：ABE10038)、IL-1 ELISA试剂盒(货号：ABE10470)、IL-8 ELISA试剂盒(货号：ABE10308)均购自上海瓦兰生物科技有限公司；IL-6 ELISA试剂盒(货号：SEKH-0013)购自北京索莱宝科技有限公司；MCP-1 ELISA试剂盒(货号：FT-P31471R)购自上海梵态生物科技有限公司。实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，RT-qPCR)仪(型号：7500)购自美国ABI公司；酶标仪(型号：INSTSUN-1)购自瑞士Tecan公司。

1.5 研究方法

1.5.1 样品采集及保存 抽取所有研究对象清晨空腹外周静脉血样置于离心管中，加同等体积生理盐水；将混匀的血样加入含有人外周血淋巴细胞分离液的离心管中；将上述样品以3 000 r/min离心30 min后取出，此时离心管最上层为血浆(收集血浆待测)，血浆层下的一白色薄层为外周血单个核细胞层；收集单个核细胞层，2 000 r/min离心5 min后取出，弃上清液，收集乳白色细胞；EP管中加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)吹悬数次，以2 000 r/min离心5 min后取出，弃上清液，重复2次或3次。

1.5.2 外周血单个核细胞AIM2水平测定 采用试剂盒提取外周血单个核细胞总RNA后反转录得cDNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用RT-qPCR仪扩增AIM2及内参GAPDH。AIM2及内参GAPDH的引物序列见表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。反应体系：cDNA模板(50 ng/μL)2 μL，SYBR®Green Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。设3个重复孔，采用2-△△CT法计算外周血单个核细胞AIM2 mRNA相对表达量。

表1 RT-qPCR引物序列(5′-3′)

1.5.3 血浆炎性因子水平检测 采用ELISA检测血浆TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平，操作步骤按试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 4组临床资料比较 对照组、SAP组、UAP组、AMI组性别、年龄、BMI、吸烟史比例、高血压比例、糖尿病比例、TC、LDL-C、TG、血糖水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；HDL-C水平比较，差异有统计学意义(P<0.001)。详见表2。

表2 4组临床资料比较

2.2 4组外周血单个核细胞AIM2 mRNA水平比较 对照组、SAP组、UAP组、AMI组外周血单个核细胞AIM2 mRNA水平依次上升，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3、图1。

表3 4组外周血单个核细胞AIM2 mRNA水平比较(±s)

图1 4组外周血单个核细胞AIM2 mRNA水平比较

2.3 4组血浆炎性因子水平比较 对照组、SAP组、UAP组、AMI组血浆TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平均依次上升，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

表4 4组血浆炎性因子水平比较(±s) 单位：pg/mL

2.4 冠心病病人AIM2 mRNA水平与炎性因子的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示：冠心病病人AIM2 mRNA水平与TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1均呈正相关(P<0.05)。详见表5。

表5 冠心病病人AIM2 mRNA水平与炎性因子的相关性分析

2.5 影响冠心病发生的多因素Logistic回归分析 将是否发生冠心病作为因变量，以AIM2、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1、HDL-C作为自变量进行Logistic回归分析，结果显示：AIM2是冠心病发生的独立危险因素(P<0.01)，HDL-C是冠心病发生的保护因素(P<0.01)。详见表6。

表6 影响冠心病发生的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

动脉粥样硬化的发病机制包括脂质浸润学说、氧化刺激学说、损伤应答学说、免疫炎症学说等，其中免疫和炎症与动脉粥样硬化密切相关[8]。冠心病病人病变局部有炎性细胞浸润，且体内炎性因子水平与心血管事件发生有关[9]。冠心病不良预后发生率极高，给家庭带来沉重的经济和医疗负担，同时影响病人生活质量和生命健康[10]。因此，分析冠心病病人体内炎症反应相关的生物指标，可能为进一步探讨冠心病发生发展提供理论基础，为治疗提供新思路。

目前研究证实TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1等炎性因子与冠心病密切相关，其中TNF-α主要由巨噬细胞和单核细胞合成，是体内重要的炎症介质，在炎症反应及免疫调节中均可发挥生物学功能，触发冠心病发生、发展[11]；IL-1通过促进B细胞增殖及抗体分泌，发挥免疫调节作用，可间接参与动脉粥样硬化的形成[12]；IL-6参与炎症反应，在炎症早期、局限性炎症及机体出现应激反应等多种因素中有不同程度升高[13]；IL-8在巨噬细胞和单核细胞合成，其他细胞可少量产生[14]；MCP-1是趋化因子CC家族成员，可与趋化因子受体结合，从而在动脉粥样硬化斑块炎症反应中发挥作用[15]。本研究通过检测SAP、UAP、AMI病人血浆炎性因子，结果显示TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1水平均高于健康人群，且AMI病人血浆炎性因子水平最高，与史丽红等[16-17]研究结果一致。AIM2可识别细胞质双链DNA，并与其结合形成炎性复合体，之后通过与热蛋白结构域相互作用招募接头蛋白，进而调节炎性因子表达[18]。张席军等[19]研究表明，乙型肝炎病毒相关性肾炎病人AIM2表达水平升高，且与IL-1β等多种炎性因子存在密切联系。本研究结果显示，健康人群、SAP病人、UAP病人、AMI病人外周血单个核细胞AIM2 mRNA水平依次上升，且AIM2是冠心病发生的影响因素。提示AIM2高表达可能与冠心病发生、发展有密切联系。进一步研究显示，冠心病病人体内AIM2 mRNA表达水平与炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1呈正相关。推测冠心病病人AIM2表达水平升高后，可感知并结合胞质双链DNA，形成复合体后促进TNF-α、IL-1、IL-6等炎性因子成熟和分泌。

综上所述，SAP、UAP、AMI的冠心病病人外周血单个核细胞中AIM2呈高表达，且与炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、MCP-1呈正相关。AIM2可能通过促进炎性因子表达，参与冠心病发生发展，推测其可能成为冠心病潜在的治疗靶点。临床应密切监测冠心病病人AIM2及TNF-α、IL-1等炎性因子水平变化，及时制定合理有效的治疗措施。今后需通过体外或体内干预AIM2表达，如建立AIM2基因敲除小鼠模型验证本研究结论。