MiR-497、CD3+、CD4+T淋巴细胞在三阴乳腺癌中表达的相关研究

王俊燕,白雪峰 ,虞 飞

(1.包头医学院,内蒙古 包头 014040；2.包头市肿瘤医院病理科)

三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是指病理报告中雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone Receptor，PR)及人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)均为阴性的乳腺癌亚型，尽管TNBC对化疗具有一定的敏感性，然而部分患者经过常规化疗后预后仍不佳。因此寻找新的靶点、探索新的治疗方案成为热点。微小核糖核酸(miRNA)是一种18～25个核苷酸长度的单链、进化高度保守的小分子非编码RNA。miRNA 在个体发育及细胞增殖、分化和凋亡等生理、病理过程中发挥重要调节功能[1]。越来越多的实验数据表明，miRNA可以 发挥致癌或抑癌效应，在癌症发生机制中发挥不可替代的作用[2]。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)反映了宿主对癌细胞的免疫反应。近年来，免疫调节剂被认为是治疗TNBC的一种新方法。大量研究表明TILs与乳腺癌患者的预后和生存有密切关系，但其与TNBC的关系研究较少。本研究通过检测 TNBC中miR-497、CD3+、CD4+T淋巴细胞的表达水平，分析其与TNBC临床病理特征的相关性，为临床寻找新的TNBC生物标志物提供参考。

1 对象与方法

1.1对象 选取2020年1月-2021年1月包头市肿瘤医院收治的60例TNBC和60例非TNBC患者，TNBC患者年龄29～79岁，≤40岁22例，>40岁38例，中位年龄58岁；绝经者23例，未绝经者37例；肿瘤大小:≤2 cm 35例，>2 cm 25例，平均2.3 cm；参考第8版美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)乳腺癌TNM分期系统：Ⅰ期 28例，Ⅱ期10例，Ⅲ期12例，Ⅳ期10例；淋巴结有转移18例，无转移42例。非TNBC患者年龄30～75岁，Luminal A型29例，Luminal B型19例，Her2过表达型12例。本研究获包头市肿瘤医院医学伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

入选标准：(1)均为女性，首次病理检查明确诊断为浸润性导管癌，免疫组化证实为TNBC；(2)既往未接受过化疗、放疗及生物免疫治疗等其他辅助治疗；(3)既往无乳腺其他疾病、内分泌激素水平及节律异常等；(4)病例资料完整。排除标准：(1)合并高血压、糖尿病及严重的心肝肾等器官功能不全；(2)合并其他系统的感染性疾病；(3)合并其他器官系统的恶性肿瘤。

1.2方法

1.2.1RT-PCR法检测各组标本中miR-497的表达 选取TNBC癌组织和癌旁组织石蜡包埋标本各60例，切成石蜡卷10卷，4 μm厚，分别装入1.5 mL EP管中。按照石蜡包埋组织切片miRNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总RNA，再分别进行浓度检测。按照miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司)对提取出的RNA进行逆转录，以cDNA为模板进行PCR扩增，引物序列表如表1，条件为95 ℃总变性 15 min后，94 ℃变性20 s，60 ℃ 退火34 s并收集荧光，40个循环。反应结束后再确认扩增曲线和溶解曲线，定量方法以2-ΔΔCT(CT值表示循环阈值)表示基因的表达量，重复3次。公式如下：

ΔΔCT=[CT(miR-497)-CT(U6)]TNBC-[CT(miR-497)-CT(U6)]癌旁组织

1.2.2免疫组化SP法检测各组标本中CD3+、CD4+T淋巴细胞的表达 石蜡组织切片厚3 μm，裱片在防脱载玻片上，65 ℃烘烤2 h，经二甲苯脱蜡后水化，滴加Tris-EDTA (pH 9.0) 修复液进行修复，高压修复2.2 min和煮沸修复20 min，再用PBS洗涤，滴加一抗37 ℃孵育1 h，用PBS洗涤后滴加二抗37 ℃孵育20 min，PBS洗净后滴加新配置的DAB试剂，3～5 min后用自来水终止反应；再经复染、分化、返蓝、脱水、透明、封片和读片观察结果。

2 结果

2.1miR-497的表达情况

2.1.1癌组织及癌旁组织中的表达量 采用RT-PCR方法检测癌组织及癌旁组织中miR-497表达量，RT-PCR溶解曲线及扩增曲线，见图1。TNBC癌组织中miR-497表达量为(16.47±1.02)，癌旁表达量为(18.9±1.04)，非TNBC癌组织中miR-497表达量为(16.2±1.48)，癌旁表达量为(20.1±1.61)。癌组织中miR-497表达量低于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。MiR-497在TNBC和非TNBC癌组织中表达量无显著相关(P>0.05)。见图2。

图1 RT-PCR溶解及扩增曲线注：A为miR-497溶解曲线图；B为 miR-497扩增曲线图。

图2 癌组织及癌旁组织中miR-497的表达注：*与TNBC癌组织相比，P<0.05；#与TNBC癌组织相比，P>0.05；+与非TNBC癌组织相比，P<0.05。

2.1.2miR-497与TNBC临床病理特征的相关性 根据TNBC中miR-497表达量的均数[3]分为低表达组26例和高表达组34例，采用χ2检验分析miR-497与患者临床病理特征的相关性。结果显示，miR-497相对表达量与年龄大小、是否绝经、肿瘤直径无明显关系(P>0.05)；而与淋巴结转移(χ2=5.70，P<0.05)、TNM分期密切相关(χ2=12.22，P<0.05)。见表2。

表2 TNBC癌组织中miR-497的表达水平与临床病理特征的相关性

2.2CD3+、CD4+T淋巴细胞表达情况 免疫组化CD3、CD4染色的肿瘤浸润T淋巴细胞的数据读取：由2名高年资病理医生在显微镜下随机选取5个200倍镜视野，对免疫组化染色的肿瘤浸润淋巴细胞进行计数，记录肿瘤间质阳性淋巴细胞数，细胞膜被染为棕色的是免疫组化标记的阳性淋巴细胞。见图3。

图3 免疫组化染色的肿瘤浸润淋巴细胞计数(×200)注：A为CD3+T淋巴细胞低计数图；B为CD4+T淋巴细胞低计数图；C为CD3+T淋巴细胞高计数图；D为CD4+T淋巴细胞高计数图)

2.2.1TNBC及非TNBC中CD3+、CD4+T淋巴细胞表达的相关性 TNBC组和非TNBC组CD3+T淋巴细胞数量差异无统计学意义(P>0.05)；TNBC中CD4+T淋巴细胞数量低于非TNBC组(表3)。

表3 TNBC及非TNBC中CD3+、CD4+T淋巴细胞表达

2.2.2CD3+、CD4+T淋巴细胞与TNBC临床病理特征的相关性 根据TNBC中CD3+、CD4+T淋巴细胞的均数分为低表达组和高表达组，TNBC中CD3+(χ2=15.67，P<0.05)、CD4+T淋巴细胞表达与淋巴结转移有关(χ2=6.61，P<0.05)，与年龄大小、是否绝经、肿瘤大小、TNM分期无关(P>0.05，表4、5)。

表4 TNBC中CD3+T淋巴细胞的表达水平与临床病理特征的相关性

3 讨论

乳腺癌干细胞受到miRNA的调控，多种miRNA参与调控乳腺癌干细胞的自我更新和分化，同时参与乳腺癌细胞上皮间质转化及调控癌细胞转移，进而影响乳腺癌的发生和发展[4]，诸如miR-4719、miR-5787、miR-204-5p、miR-183-5p、miR-10b低表达，miR-27a[5]、miR-105、miR-222、miR-21、miR-346、miR-137高表达。肿瘤组织中CD3+T淋巴细胞数量较多时，可能免疫系统对恶性细胞处于应激状态，CD3+T淋巴细胞浸润密度升高有利于疾病生存期的延长[6]。TNBC中CD4+T淋巴细胞数量低者，总生存率降低[7]，可以作为潜在预后标志。

表5 TNBC中CD4+T淋巴细胞的表达水平与临床病理特征的相关性

CD4+T细胞激活需要T细胞受体(T Cell Receptor，TCR)信号的刺激，CD4+T细胞上的TCR识别成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)表面主要组织相容复合物Ⅱ(MHCⅡ)呈递的抗原肽，通过多个受体的结合启动一系列相互作用[8]。在与DC的相互作用中，初始CD4+T细胞能够分化为具有不同功能的抗原特异性效应性T细胞。T细胞衰竭描述的是效应T细胞中细胞因子表达和效应功能下降，并且对再激活有抵抗作用。在肿瘤中，T细胞的长期激活会发生T细胞衰竭效应，衰竭的T细胞表现为白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)、干扰素γ(interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达明显降低，并且细胞周期停滞。衰竭的T细胞表达多种抑制性表面分子，有效防止T细胞活化，其中程序性死亡蛋白-1(programmed cell death protein-1，PD-1)是抑制性分子之一[9-12]。miRNA调节免疫检查点PD-1 / PD-L1的表达[13-14]，这可能与miRNA与PD-L1 mRNA的3′UTR结合有关,意味着miRNA调节DC功能间接影响T细胞激活。当DC过表达程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1，PD-L1)时，一些细胞因子表达降低，CD3+、CD4+T淋巴细胞的免疫功能将受到限制。本研究结果表明在TNBC中，miR-497与淋巴结转移及TNM分期相关，CD3+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞与淋巴结转移有关，三者可能视为TNBC潜在的生物学标志物，关于三者的相关性，我们猜测miR-497调节PD-L1的表达，进而影响CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞的表达情况。

在本研究中TNBC中CD3+T淋巴细胞计数与非TNBC中CD3+T淋巴细胞计数无统计学意义，可能说明CD3+T淋巴细胞在TNBC中的免疫作用与其他分型乳腺癌相同，但与之前研究结果不同，有报道称CD3+T淋巴细胞数量在TNBC组与非TNBC组中有差异性，且TNBC中CD3+T淋巴细胞数量低于非TNBC[15]，由于目前研究有限，具体有无关联还需要进一步探索。TNBC中CD4+T淋巴细胞数量低于非TNBC中的数量，其原因可能是与其他亚型相比，TNBC中肿瘤细胞过表达PD-L1[16]，PD-L1表达的增加导致CD4+T淋巴细胞的衰竭[17]。

综上所述，TNBC中CD4+T淋巴细胞数量低于非TNBC组，这表明了CD4+T淋巴细胞在TNBC中起着重要免疫作用。在TNBC组织中miR-497表达量下调，且与肿瘤的分期及淋巴结转移有关；CD3+、CD4+T淋巴细胞数量与淋巴结转移有关。说明三者可能成为TNBC的潜在的预后标志物及治疗靶点，并在诊断和治疗上起到一定作用，但关于它们在TNBC中具体调控机制尚未明确，有待进一步研究。