结肠癌患者肠黏膜组织定植菌群的结构变化及其临床意义

王 博

结肠癌是发生在结肠部位的消化道恶性肿瘤，发病率居恶性肿瘤第3位，病死率居恶性肿瘤第5位，40～50岁为高发年龄，男女之比为2∶1～3∶1[1]。随着人类生活水平提高，饮食结构发生变化，结肠癌发病率逐年增加，严重影响人类生命安全[2]。肠道定植菌群在生理状态下处于动态平衡，当这种平衡遭到打破，肠道定植菌群结构发生改变，肠黏膜免疫调节紊乱，肠道屏障功能出现异常，导致组织恶变。有研究认为[3]肠道定植菌群失调是诱发结肠癌的关键因素，但由于受到实验条件、仪器精度、自身能力、研究方法等因素限制，现阶段关于肠道定植菌群在结肠癌发生、发展过程中作用的研究较少。因此本研究探讨结肠癌患者肠黏膜组织定植菌群的结构变化及其与病情程度的相关性，以期为临床防治结肠癌提供新的方向，现将研究结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年11月至2020年11月我院收治的97例结肠癌患者为病例组，同期我院收治的97例结肠腺瘤患者为对照组。病例组：男性69例，女性28例；年龄40～80岁，平均年龄(56.23±5.45)岁；体质量指数(23.49±3.33)kg/m2；吸烟史34例；饮酒史39例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期51例，Ⅲ～Ⅳ期46例；淋巴结转移：无淋巴结转移49例，有淋巴结转移48例。对照组：男性70例，女性27例；年龄40～78岁，平均年龄(56.47±5.58)岁；体质量指数(23.51±3.25)kg/m2；吸烟史35例；饮酒史40例。2组年龄、性别、体质量指数、吸烟史、饮酒史等一般资料无显著差异(P>0.05)。纳入标准：①2组患者经病理活检确诊；②入院前未接受任何抗结肠癌、结肠腺瘤治疗；③依从性好，能配合完成本研究；④所有研究对象对本研究内容知情了解，并签订知情同意书。排除标准：①病历资料不详细；②心、肝、肾、肺等重要脏器功能不全；③哺乳期或妊娠期女性；④合并其他肿瘤、其他胃肠道疾病、过敏性疾病、自身免疫系统疾病、感染性疾病、传染性疾病、心脑血管疾病、精神系统疾病、血液系统疾病。本研究上报我院医学伦理委员会并获得批准。

1.2 研究方法

记录所有研究对象入院时的年龄、性别、体质量指数、吸烟史、饮酒史等一般资料，收集病例组手术切除的结肠癌组织和对照组手术切除的结肠腺瘤组织，采用基因组DNA提取试剂盒(北京凯瑞基生物科技有限公司)提取2组患者肠黏膜组织中基因组DNA，所提取的DNA采用分光光度计(东莞市谱标实验器材科技有限公司)检测其浓度和纯度，对细菌16srRNA基因V4区进行PCR扩增，PCR扩增体系为：Primer (2 μM)3 μL；Phusion Master Mix (2×)15 μL；gDNA 10 μL，H2O2μL，总体积30 μL；PCR反应条件为：98℃预变性1 min，98℃变性10 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，39次循环。细菌16SrDNA的引物为：515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')/806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，应用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(上海劢瑞生物科技有限公司)对PCR产物纯化，应用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(美国Promega公司)对PCR产物定量，应用Illumina Miseq平台(武汉华大基因公司)进行高通量测序，应用COPE软件(北京奥维森基因科技有限公司)统计样品序列数目，在0.97相似度下应用QIIME序列分析软件(北京环中睿驰科技有限公司)将序列聚类为用于物种分类的OTUs，结合物种组成信息结果，分析2组患者肠黏膜组织定植菌群结构及丰度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 2组患者肠黏膜组织定植菌群结构差异

门水平：病例组患者肠黏膜组织中厚壁菌门丰度显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；病例组患者肠黏膜组织中变形菌门丰度显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)属水平：病例组患者肠黏膜组织中真杆菌属丰度显著低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；病例组患者肠黏膜组织中梭杆菌属丰度显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组患者肠黏膜组织定植菌群结构差异

2.2 不同临床分期的结肠癌患者肠黏膜组织定植菌群结构差异

门水平：Ⅲ～Ⅳ期结肠癌患者肠黏膜组织中厚壁菌门丰度显著低于Ⅰ～Ⅱ期结肠癌患者，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期结肠癌患者肠黏膜组织中变形菌门丰度显著高于Ⅰ～Ⅱ期结肠癌患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。属水平Ⅲ～Ⅳ期结肠癌患者肠黏膜组织中真杆菌属丰度显著低于Ⅰ～Ⅱ期结肠癌患者，差异具有统计学意义(P<0.05)；Ⅲ～Ⅳ期结肠癌患者肠黏膜组织中梭杆菌属丰度显著高于Ⅰ～Ⅱ期结肠癌患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同临床分期的结肠癌患者肠黏膜组织定植菌群结构差异

2.3 不同淋巴结转移情况的结肠癌患者肠黏膜组织定植菌群结构差异

门水平：有淋巴结转移结肠癌患者肠黏膜组织中厚壁菌门丰度显著低于无淋巴结转移结肠癌患者，差异具有统计学意义(P<0.05)；有淋巴结转移结肠癌患者肠黏膜组织中变形菌门丰度显著高于无淋巴结转移结肠癌患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。属水平：有淋巴结转移结肠癌患者肠黏膜组织中真杆菌属丰度显著低于无淋巴结转移结肠癌患者，差异具有统计学意义(P<0.05)；有淋巴结转移结肠癌患者肠黏膜组织中梭杆菌属丰度显著高于无淋巴结转移结肠癌患者，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同淋巴结转移情况的结肠癌患者肠黏膜组织定植菌群结构差异

2.4 spearman相关性分析

结肠癌患者肠黏膜组织中变形菌门、梭杆菌属丰度与临床分期、淋巴结转移呈正相关(P<0.05)；结肠癌患者肠黏膜组织中厚壁菌门、真杆菌属丰度与临床分期、淋巴结转移呈负相关(P<0.05)(表4)。

表4 结肠癌患者肠黏膜组织定植菌与临床分期、淋巴结转移的相关性

3 讨论

结肠癌早期通常表现为消化不良、腹胀、排便习惯改变等无特异性的症状，随着病情进一步发展可出现肺、脑、肝、骨等组织脏器转移，出现肠梗阻、淋巴结肿大、肺水肿、黄疸、腹腔积液等转移征象，危及患者生命。现阶段临床治疗结肠癌主要采用手术为主、放化疗为辅的综合性治疗方案，能够缓解临床症状，缩小原发癌灶，降低临床分期，提高生存率，但因结肠解剖关系复杂，手术不能彻底切除，癌细胞可向腹腔内种植，沿肠壁浸润、扩散，沿手术切口面转移，患者往往预后不良。因此探讨结肠癌发病机制对提升患者预后有重要意义。

结肠癌发病是一个多步骤、多因素、多途径的过程，涉及分子遗传学改变和组织形态学变化，家族史、溃疡性结肠炎、结肠息肉、高脂肪饮食、低纤维素饮食等均为结肠癌的高危因素[4]。随着分子生物学技术的不断发展，宏基因组学的深入研究，二代测序技术的广泛应用，肠道定植菌群在结肠癌发病过程中的作用成为近年来临床的研究热点。肠道定植菌群是肠道内的正常菌群，定植于肠道黏膜上，与机体生理代谢、肠道稳态、肠黏膜免疫调节关联密切。肠道定植菌群在生理状态下处于动态平衡，当这种平衡遭到打破，肠道定植菌群结构发生改变，肠黏膜免疫调节紊乱，肠道屏障功能出现异常，导致组织恶变[5]。厚壁菌门是人体健康状态下肠道内的专性厌氧菌，对维持宿主健康发挥着十分重要的作用[6]。丁酸盐产生菌是一类肠道内可发酵产生大量短链脂肪酸的细菌，能够维持肠上皮细胞完整性，保护宿主肠壁，调节肠道免疫应答，为肠道提供能量，减少DNA氧化损伤，降低肠道炎症，减弱致癌酶活性，抑制肿瘤形成。真杆菌属是目前已知的丁酸盐产生菌之一，被认为是有益菌[7]。梭杆菌属是一种革兰阴性专性厌氧菌，具有侵袭、粘附、促炎症发生的作用，与炎性肠病发病有关[8]。有研究发现[9]梭杆菌属能够通过E-钙粘蛋白(E-cadherin)和β-连环素(β-catenin)信号促进结直肠癌发病。变形菌门是细菌中最大的一门，其中γ-变形菌纲包含了很多重要的条件致病菌，可引起肠道微环境改变，导致肠道定植菌群整体结构失衡[10]。本研究显示病例组患者肠黏膜组织中厚壁菌门、真杆菌属丰度显著低于对照组，病例组患者肠黏膜组织中变形菌门、梭杆菌属丰度显著高于对照组，提示结肠癌患者肠黏膜组织定植菌群结构发生了明显改变，出现了有益菌减少、有害菌增加的肠道定植菌群结构失调现象，这与既往研究报道一致[3]，我们推测肠道定植菌群失调可能是诱发结肠癌的因素之一。本研究显示结肠癌患者肠黏膜组织中变形菌门、梭杆菌属丰度与临床分期、淋巴结转移呈正相关，结肠癌患者肠黏膜组织中厚壁菌门、真杆菌属丰度与临床分期、淋巴结转移呈负相关，提示肠道定植菌群失调可能是导致结肠癌病情进展的间接原因。

综上所述，结肠癌患者肠黏膜组织定植菌群结构发生了明显改变，出现了有益菌减少、有害菌增加的肠道定植菌群结构失调现象，且这种失调现象随着结肠癌病情程度的增加而加重，肠道黏膜菌群结构鉴定有望成为结肠癌高风险人群筛查的途径之一，调节肠道菌群有望成为防治结肠癌的新方法。鉴于本研究纳入病例数较少，研究时间较短，未对患者性别、年龄、种族、长期饮食习惯等临床资料进一步分析，因此有待进一步研究，更加确切了解肠道定植菌群在结肠癌发生及进展过程中的作用机制，为结肠癌的诊断、治疗提供更为有力的证据。