ERCC1表达及基因多态性与口腔鳞状细胞癌患者临床特征及生存期的关系

周志坤 田艳红 徐 婷 赵美玲 岳 颖

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是临床常见发于头颈部的恶性肿瘤，尽管现代技术方法已经得到改善和提高，但晚期OSCC患者5年生存率不到一半，给患者生命健康造成严重威胁[1]。OSCC发生发展是由多因素、多信号调控以及多种环境共同参与的复杂过程[2]。切除修复交叉互补基因1(excision repair cross complementing 1，ERCC1)编码一种DNA核酸内切酶，该酶是核苷酸切除修复途径的关键酶，其与肿瘤的发生和预后有密切关系[3]。研究显示[4]，ERCC1与口腔鳞状细胞癌恶性基因表型有关，其异常表达与肿瘤发生、临床分期以及淋巴结转移具有相关性。既往研究显示[5]，ERCC1低表达提示宫颈癌预后不良。由于ERCC1基因存在不同的基因多态性，不同个体的DNA核苷酸切除修复能力也不同，从而表现出的临床特征也不同。既往研究显示[6]，ERCC1基因多态性可以影响基因表达量，从而在多种肿瘤的化疗反应中发挥重要作用。本研究采用免疫组化法分析ERCC1在OSCC癌组织和癌旁组织中蛋白表达情况，探讨ERCC1表达差异及基因多态性与OSCC临床特征、生存期的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2015年7月至2018年7月我院收治的口腔鳞状细胞癌患者62例作为观察对象。所有患者均在本院行外科手术后接受辅助化疗治疗，且患者经病理组织学检查确诊。纳入标准：患者年龄>18岁；患者预计生存时间>3月；首次确诊并接受治疗；患者及患者家属对本项研究知情且自愿签署知情同意书；临床资料完整者。排除标准：严重恶液质的患者；合并其他恶性肿瘤患者；存在其他重要器官严重损伤患者；中途更改治疗方案患者。本研究已获得本院医学伦理委员会批准并实施。

1.2 主要试剂

鼠抗人ERCC1蛋白单克隆抗体购于江西江蓝纯生物试剂有限公司；质谱仪购于上海赛默飞色谱质谱；研究中所用试剂盒购于杭州博日科技股份有限公司。1.3 免疫组化检测ERCC1蛋白表达

手术切取患者癌组织和癌旁组织，将组织样本采用常规石蜡包埋，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水处理后采用免疫组化二步法进行免疫组化染色，采用双氧杉二氨基联苯胺进行反应染色，PBS溶液充分冲洗，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，普通光学显微镜下观察并拍照。着色评分：不着色计为0分；淡黄色计为1分；棕黄色计为2分；褐色计为3分。染色肿瘤细胞所占比例评分 ：≤10%计为0分；>10%～30%计为1分；>30%～60%计为2分；>60%计为3分。合计两项得分后≥3分定义为阳性，<3分定义为阴性。

1.4 DNA提取及其多态性分析

采集患者外周静脉血5 mL于抗凝管中，采用TaKaRa全血DNA试剂盒操作步骤进行提取DNA，采用质谱法分析ERCC1 C8092A位点分布情况。

1.5 随访

随访自病理确诊之日开始计算，随访36个月。随访方式为电话、短信、门诊复查、住院观察等多种形式相结合，随访频率为每3、6个月随访1次，所有患者都获得完整随访。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 ERCC1在OSCC组织和癌旁组织中表达情况

癌组织中ERCC1染色面积大、着色程度强、主要细胞质着色。口腔鳞状癌组织中ERCC1阳性表达45例，阳性表达率72.58%；癌旁组织中ERCC1阳性表达17例，阳性表达率27.42%。ERCC1在OSCC 癌组织中阳性表达率明显高于癌旁组织中阳性表达率(χ2=25.290，P<0.05)。

2.2 ERCC1表达与OSCC患者临床参数相关性分析

ERCC1表达阳性与肿瘤淋巴结转移、临床分期有关(P<0.05)，与患者性别、年龄、分化程度、肿瘤分期和肿瘤大小无关(P>0.05)。见表1。

2.3 ERCC1差异表达与OSCC患者生存期的关系

随访36个月，结果显示，45例ERCC1阳性表达患者中位生存期为27.80个月，17例ERCC1阴性表达患者中位生存期为30.00个月，两者之间无显著性差异(P>0.05)。见图1。

图1 ERCC1差异表达与OSCC患者生存期的关系

2.4 患者ERCC1基因C8092A位点相关分析

ERCC1基因C8092A位点有3种基因型：野生型(CC)、杂合型(CA)和突变纯合型(AA)。ERCC1阳性表达患者CA基因型分布最多(60.00%)，ERCC1阴性表达患者CC基因型分布最多(62.50%)，ERCC1阳性表达与阴性表达患者C8092A基因型分布差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 62例患者ERCC1基因C8092A位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验(例，%)

2.5 ERCC1基因C8092A位点与OSCC患者生存期的关系

在C8092A位点上，CC患者18例，CA患者32例，AA患者12例。36个月随访，CC和CA患者中位生存期为31.10个月和32.80个月，均长于AA患者中位生存期21.80个月，差异具有统计学意义(P<0.05)。CC和CA患者中位生存期比较无统计学差异(P>0.05)，见图2。

图2 C8092A位点上的生存期

3 讨论

OSCC临床特征多不显著，临床诊断容易被忽视，其发病率和死亡率常年居高不下。OSCC临床常采用手术治疗，但术后患者面容及口腔咀嚼功能常常受损，严重影响进食、语言和社会交往等[7]。越来越多的研究者致力于分析OSCC发病的分子机制，试图实现OSCC的早期发现和早期治疗。

本研究结果显示，癌旁组织中ERCC1阳性表达率明显低于癌组织，这与前人的多数研究结果基本一致[8]。在ERCC1表达与临床病理特征关系上，ERCC1异常表达与患者年龄、性别、分化程度、肿瘤分期、肿瘤大小以及发病部位无关，仅在淋巴结转移和临床分期中存在显著性差异。但有研究结果表现在分化程度上ERCC1表达也有差异[9]，究其原因可能与ERCC1检查方法、评定标准以及样本量等因素有关。本研究结果说明ERCC1异常表达与OSCC临床恶性表型有关。

肿瘤的发生发展过程是多基因共同调控的生理过程，癌基因和抑癌基因的表达出现失衡是OSCC 患者主要病机[10]。本研究结果显示ERCC1蛋白表达与患者生存期无明显关联，而在分析患者ERCC1基因多态性C8092A位点后，发现ERCC1阳性表达与阴性表达患者C8092A基因型分布差异具有统计学意义。本研究结果说明ERCC1差异表达对患者预后影响较小，而ERCC1基因多态性C8092A位点不同基因分型可能与患者生存期有关。为此，本文进一步比较不同基因型患者生存期，发现CC和CA患者中位生存期长于AA患者，其与患者生存期存在一定程度的关系。ERCC1是第一个克隆而得的人类DNA损伤修复基因，研究显示，ERCC1基因表达可以提示患者DNA修复功能较差、病情反复且通常患者预后不佳[11]。既往研究显示[12]，食管鳞状上皮癌患者ERCC1基因在C80921A位点时，CC、CA和AA患者生存时间具有统计学差异。研究显示[13]，ERCC1基因多态性可能影响ERCC1表达以及蛋白功能，限制性内切酶功能受损，增加基因组的不稳定性，导致肿瘤发生恶性转化。但本文并未对此深入探究，这是本文的局限性之一。本研究结果提示，ERCC1基因多态性C8092A位点CC和CA基因患者生存期较长，预后较AA基因型患者好，AA基因型携带者罹患OSCC更容易发生肿瘤恶化。

综上所述，ERCC1表达与肿瘤淋巴结转移、临床分期有关，可作为OSCC诊断指标，用于评估患者预后情况。ERCC1表达与患者生存期无显著性关系；而CC和CA患者中位生存期长于AA患者中位生存期，临床治疗和改善OSCC患者预后可从ERCC1基因分型着手，重点关注CC和CA基因型患者。尽管本研究可为临床治疗此类患者提供数据支持，但本研究尚存在一定的局限性。首先，本研究样本量相对偏小，且为单中心研究，数据可能存在偏倚；其次，缺乏ERCC1基因多态性影响ERCC1基因表达的直接数据；最后，本文仅分析单一基因及其多态性在OSCC中的作用，然而肿瘤的发生发展过程往往伴随着多基因的突变与调控。这些不足之处将是今后研究的重点。