单激发双发射氮掺杂碳量子点的制备及其在生物成像和荧光油墨中的应用

张长波,何文柔,田丰玲，姜 丽,易 伟，2,唐 珊,吴 韵,王兴益,张仟春*

(1.兴义民族师范学院 生物与化学学院,贵州 兴义 562400;2.黔西南州食品和环境污染物分析重点实验室,贵州 兴义 562400)

0 引言

碳量子点(Carbon quantum dots, CDs)是一种新型的零维碳纳米材料，自2004年首次被发现以来受到了研究者们的持续关注[1-2]。与传统的半导体量子点和有机荧光染料相比，CDs具有优异的光学性能及良好的生物相容性[3-4]，并在传感、生物成像等前沿研究领域得到了广泛的应用[5-6]。有研究显示，目前人们已发展了多种合成CDs的方法，如水热法、溶剂热法、微波辅助法、电化学氧化法和激光消蚀法等等，其中水热法，因其操作简单、条件可控、稳定性好，应用较为广泛[5-8]。

以往研究显示，CDs大多发射波长较短的蓝光或绿光，与生物体自身的背景荧光相近[9-11]，且多数CDs其荧光性能和稳定性易受酸碱、盐或生物小分子的影响，从而限制了它们在生物光学成像等领域的应用。此外，样品不均匀、光源不稳定等外界因素也会严重影响单发射荧光探针的信号强度[12]。因此，如何制备出能够发射长波长荧光的CDs，尤其是单激发双发射的CDs引起了相关研究者们的关注。有研究表明，CDs的发光特性可以在制备过程中通过原子掺杂(氮、磷、硫、硼等)进行调控[3-4,7,10,13-18]。这是因为：氮原子与碳原子的大小相似，且外层具有的五价电子与碳原子有着很强的键合，当通过掺杂其它原子对碳量子点的荧光进行调节时，氮是较为理想的掺杂原子[3-4,7,14]；硼、磷、硫等原子也可以与氮一起被掺杂进碳量子点中[16-18]。如：Li等[17]以亚甲膦酸和间苯二胺为前驱体合成了氮、磷共掺杂的碳量子点，此碳量子点在440 nm的激发波长下发出绿色荧光；Shi等[18]提出以水热法来制备蓝光发射的氮、磷共掺杂的碳量子点，并将其用于Fe3+的测定；Liu等[16]制备了硼、氮、硫共掺杂的红光碳量子点，其发射峰位于600 nm，荧光量子产率约为6%。但采用较简单的合成路线制备出发射波长较长且荧光量子产率较高的碳量子点仍然挑战巨大。

基于此，本研究以L-苹果酸为碳源、3,3′-二氨基二丙胺和氟化铵为氮源，采用简单、经济的一锅水热法制备了氮掺杂碳量子点(Nitrogen-doped carbon quantum dots, N-CDs)，并对所合成的N-CDs的发光性能和稳定性进行探究，结果表明该N-CQDs具有单激发双发射的荧光特性和出色的稳定性，同时，经验证其可应用于生物成像或作为荧光油墨。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

L-苹果酸(98%)、3,3′-二氨基二丙胺(>98%)、硫酸奎宁(98%)、谷胱甘肽、Y-氨基丁酸、褪黑素、链霉素、脱落酸、甲基睾酮和孕三烯酮，购自中国上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氟化铵和L-抗坏血酸，购自西陇科学股份有限公司；盐酸、硫酸、氯化钠和氢氧化钠，购自重庆川东化工有限公司；L-半胱氨酸，购自天津市福晨化学试剂厂；酪氨酸、色氨酸、噻苯咪唑和3-吲哚乙酸，购自北京百灵威科技有限公司。实验所用试剂均为分析纯，用水均为超纯水。

高分辨透射电子显微镜(HRTEM, Hitachi-F20)；Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱(FT-IR, 美国赛默飞世尔)；X射线粉末衍射(XRD, Bruker D8)；AL104电子天平(瑞士梅特勒-托丽多)；KQ5200DE超声波清洗机(中国昆山)；RF-6000荧光分光光度计(日本岛津)；UV-5500分光光度计(上海元析)；高温试验箱(上海力辰邦西)；pH计(瑞士梅特勒-托利多)、紫外灯(ZF-20D手持式)。

1.2 氮掺杂碳量子点的制备

氮掺杂碳量子点的典型制备过程如下：首先，将2 mmol(0.074 g)的氟化铵、2 mmol (0.262 g)的3,3′-二氨基二丙胺和4 mmol(0.536 g)的L-苹果酸溶于10 mL水中，超声10 min将其混合均匀；然后转移至50 mL聚四氟乙烯内衬的高压釜内，密封后置于200 ℃烘箱内反应18 h，结束反应；最后，反应釜取出后冷却至室温，将反应溶液超声分散10 min，后经0.22 μm滤膜过滤纯化，放置于4 ℃冰箱中保存待用，实验前用超纯水稀释。

1.3 氮掺杂碳量子点的表征

通过HRTEM、XRD、FT-IR等研究了N-CDs的形貌及结构。将硫酸奎宁溶解于0.1 mol/L的H2SO4溶液中作为标准溶液(其荧光量子产率为54%，激发波长350 nm)进行参照[8]，测量其荧光量子产率。

1.4 氮掺杂碳量子点的生物成像及荧光油墨

1)生物成像：取50 μL的N-CDs溶液(87.2 mg/mL)加至含50 mL水的烧杯内，然后与3月龄斑马鱼在室温条件下共培育72 h后，用水清洗斑马鱼，在365 nm紫外灯照射下成像；将黄豆在室温条件下浸泡12 h，放到打孔的塑料瓶中，室温条件下待其发芽，用N-CDs溶液(87.2 μg/mL)共培育12 h，于365 nm紫外灯照射下成像。

2)荧光油墨：用棉签蘸取N-CDs溶液，在无荧光滤纸上进行绘画与书写，于365 nm紫外灯照射下拍摄成像。

2 结果与分析

2.1 氮掺杂碳量子点制备条件优化

为得到荧光性能优异的N-CDs，探讨了3,3′-二氨基二丙胺、氟化铵和L-苹果酸的摩尔比、浓度、制备温度及制备时间等制备条件对荧光强度的影响。经验证，3,3′-二氨基二丙胺、氟化铵和L-苹果酸的摩尔比、浓度、制备温度及制备时间在N-CDs合成中发挥着至关重要的作用。由图1(A)可见，在3,3′-二氨基二丙胺、氟化铵和L-苹果酸的摩尔比为2∶2∶4的条件下荧光信号最强；由图1(B)可知，当N-CDs浓度在58.1～87.2 mg/mL的范围内，荧光强度会先随着浓度的增加而增大，并在87.2 mg/mL时达到最大值，当N-CDs的浓度继续增大超过87.2 mg/mL时，荧光强度不升反降，原因可能是较高浓度N-CDs聚集诱导荧光淬灭所致[6]，因此，制备N-CDs的最佳浓度为87.2 mg/mL；由图1(C)可见，荧光信号强度随反应温度的升高而增强，并在220 ℃时达到最大值，考虑高压反应釜的承压上限及实验的安全性，最佳制备温度选择220 ℃；最终考察了N-CDs的反应时间，见图1(D)，反应时间为18 h时，荧光信号强度最佳。综上可知，最优的制备条件为3,3′-二氨基二丙胺、氟化铵和L-苹果酸的摩尔比为2∶2∶4，浓度为87.2 mg/mL，制备温度为220 ℃和反应时间为18 h。

图1 N-CDs制备条件优化Fig.1 Optimization of preparation conditions of N-CDs

2.2 氮掺杂碳量子点的表征

N-CDs的TEM表征结果如图2(A)所示，所合成的N-CDs是近圆球状的纳米颗粒，且单分散性良好；从图2(A)的插图可知，该N-CDs的平均粒径为3.3 nm。图2(B)为N-CDs的高分辨透射电镜图，晶格常数为0.27 nm；对N-CDs进行XRD表征得到图2(C)，2θ=22.8°处的衍射峰与石墨烯量子点的(002)面相对应，这与HRTEM分析结果一致[7]。

图2 N-CDs的形貌和结构图Fig.2 Images of the morphology and structure of N-CDs

通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对N-CDs表面结构进行分析，如图2(D)所示，3 130 cm-1处的宽峰归因于O-H和N-H的伸缩振动，1 640 cm-1处的峰是由C=O和C=C的不对称伸缩振动所致，1 410 cm-1处的吸收峰归因于C-N的拉伸振动；而744 cm-1处的吸收峰归因于C-H的面外弯曲振动[6-7]。FT-IR分析结果表明，该N-CDs表面可能含有-COOH、-OH和-NH2三种亲水的官能团，由此导致所合成N-CDs具有亲水性且易均匀分散，这有利于生物成像和作为荧光油墨。

2.3 氮掺杂碳量子点的光学性质

利用荧光分光光度计测试N-CDs的三维荧光光谱，如图3(A)所示。非常有趣的是，激发范围在300～420 nm，发射范围在350～500 nm和700～900 nm，即在不同激发波长下，该N-CDs具有明显的单激发双发射荧光特性，且发射光谱显示出激发依赖性，这可能是源自共轭π域的发射以及表面缺陷所致[19]。进一步通过UV-vis和荧光分光光度计考察了N-CDs的光学吸收光谱，如图3(B)所示。N-CDs在紫外和可见光区均有明显的吸收，340 nm处特征吸收峰(黑线)归因于C=O双键的n-π*跃迁[20-21]。在荧光光谱中，N-CDs的最佳激发波长(红线)为350 nm、最佳发射波长(蓝线)为425 nm和850 nm。所得N-CDs溶液在日光下呈浅黄色，在手持紫外灯下(365 nm)呈现出强烈的蓝色荧光(图3(B)插图)。如图4所示，以硫酸奎宁(QYQS=54.0%)为荧光标准物，测得所制备N-CDs量子产率为17.5%。

图3 N-CDs的光谱图Fig.3 The spectra of N-CDs

图4 N-CDs的荧光量子产率Fig.4 Fluorescence quantum yield of N-CDs

2.4 氮掺杂碳量子点的稳定性

量子点的稳定性是决定其能否成功应用的重要参数之一。实验考察了所制备N-CDs的光学、酸碱、抗盐和抗生物小分子的稳定性。由图5(A)可见，白光照射长达14 h，N-CDs在425 nm和850 nm处的发射峰荧光强度基本保持不变，这表明所合成N-CDs在水溶液中具有优异的光学稳定性。为探究溶液酸碱度对N-CDs荧光强度的影响，利用HCl和NaOH调控溶液pH为1.0～13.0，于激发波长350 nm下测定其荧光强度，pH测试结果如图5(B)所示，pH的变化对N-CDs荧光强度的影响基本不大，425 nm和850 nm处的发射峰荧光强度在pH为2.0～12.0较大的范围内保持相对稳定。为考察N-CDs受离子和共存生物小分子的干扰情况，分别加入不同浓度的NaCl和生物小分子后测定425 nm和850 nm处的荧光强度值。实验结果表明，425 nm和850 nm处的荧光强度值(见图5(C)和图5(D))几乎不发生改变。综上可见，所合成N-CDs具有优异的光学、酸碱、抗盐和抗生物小分子稳定性，这有利于N-CDs在生物成像、荧光油墨等方面的应用。

图5 N-CDs的荧光稳定性Fig.5 Fluorescence stability of N-CDs

2.5 氮掺杂碳量子点应用于生物成像和荧光油墨

为了证实N-CDs在活体生物成像应用的可行性，将3月龄斑马鱼(图6(A1))和豆芽(图6(B1))与质量浓度为87.2 μg/mL的N-CDs共培育后，并在365 nm紫外光照射下进行观察拍摄。结果显示，斑马鱼经12 h共培育后，只有头部出现荧光(图6(A2))，24 h后鱼身部分出现荧光(图6(A3))，随着共培育时间延长至36 h，斑马鱼全身出现荧光，荧光成像效果极佳(图6(A4))；浸泡发芽的黄豆(图6(B1))与N-CDs溶液共培育12 h后，荧光无法穿过厚度较厚的子叶，只有豆芽的胚根和胚轴部分出现荧光(图6(B2～B4))。该结果表明N-CDs具有良好的渗透性能和生物相容性，可作为生物体成像的探针使用。

图6 斑马鱼和豆芽与0.872 mg/L N-CDs培育的图像Fig.6 Photographic images of zebrafish and bean sprouts incubated with 0.872 mg/L N-CDs

时至今日，荧光油墨正被普及用于印刷领域，将来还可以用于信息存储和信息加密。由于其优异且稳定的荧光性能，所制备的N-CDs溶液可用作荧光油墨。经验证，在无荧光的滤纸上，利用N-CDs可绘制各种各样的卡通形象(图7(A))，在365 nm紫外光照射下，生动的卡通形象显现出独特的亮蓝色荧光(图7(B))。

图7 利用N-CDs作为荧光墨水在滤纸上绘制的不同卡通形象分别在自然光和紫外线照射条件下的图像Fig.7 Photographic images of different cartoon stamps using N-CDs as a fluorescent ink on filter paper under day light and UV light illumination

3 结论

以L-苹果酸、3,3′-二氨基二丙胺和氟化铵为前驱体，通过简单的水热法一步成功地合成了N-CDs。该N-CDs拥有特殊的单激发双发射的荧光特性，最大的激发波长为350 nm，最大发射波长分别为425 nm和850 nm，其荧光量子产率为17.5%。此外，N-CDs具有优异的光学、酸碱、抗盐和抗生物小分子稳定性，既可用于斑马鱼和豆芽的生物成像，又可作为荧光油墨用于成像。