气相色谱法同时测定替格瑞洛片中14种残留溶剂

曹桂红,王兴宁,刘 璐,黄春青,许 波*

(1.贵州省食品药品检验所,贵州 贵阳 550004;2.贵阳海关综合技术中心,贵州 贵阳 550081)

0 引言

替格瑞洛(Ticagrelor)是一种新型、选择性小分子抗凝血的非前体药物[1]，为可逆性P2Y12受体拮抗剂[2-3]，通过与血小板上的P2Y12受体可逆结合，可迅速抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集，发挥抗血小板聚集、扩张血管作用，有效抑制动脉粥样化血栓的形成，其制剂替格瑞洛片用于治疗急性冠状动脉综合征(Acute coronary syndrome，ACS)。2012年11月批准上市，商品名为倍林达(Brtilita)[4]，因相比氯吡格雷具有起效快、个体差异小、出血风险降低等优点而得到广泛关注，目前替格瑞洛片已在全球多个国家获批[5-7]。

替格瑞洛的合成路线复杂，通过调研收集到3家生产企业的合成工艺路线图。这3条合成路线都是对3个关键中间体即嘧啶环、五元环和三元环进行缩合、环合、再缩合、酸解、重结晶得到替格瑞洛。合成过程中涉及甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氢呋喃、异辛烷、正庚烷、二氧六环、甲苯、N,N-二异丙基乙胺、二氯甲烷、乙二醇等14种有机溶剂。当前替格瑞洛原料药的标准中，残留溶剂的检验方法为采用气相色谱法分3个系统分别测定6种、4种和3种残留溶剂。有研究显示，用顶空气相色谱法可测定替格瑞洛中的8种残留溶剂[8]，毛细管气相色谱法可测定替格瑞洛中溶剂残留量[9-10]。为控制该制剂中残留溶剂的量，本研究对替格瑞洛片中的14种残留溶剂进行了溶解、提取，并建立了气相色谱法同时测定替格瑞洛片中14种残留溶剂。

1 仪器与材料

岛津2030气相色谱仪、包括FID检测器(日本岛津公司)；毛细管柱DB-624(75 m×0.53 mm×3 μm，美国安捷伦公司)；电子天平(XS205DU，美国METTLER公司)。

溶剂：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氢呋喃、异辛烷、正庚烷、二氧六环、N,N-二异丙基乙胺、乙二醇、甲苯及乙醇及正丙醇(内标)均为(色谱纯，上海安谱公司)。

替格瑞洛片来源于8个厂家的60批次日常检验样品。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：DB-624毛细管柱(75 m×0.53 mm×3 μm)；进样口温度：200 ℃； 检测器温度：250 ℃；载气：氮气(纯度>99.999%)；柱流量：5 mL/min；进样量：2 μL；分流比为10∶1；程序升温：起始温度35 ℃，保持14 min，以60 ℃/min升温至60 ℃，保持7 min，再以60 ℃/min升至150 ℃，保持15 min。14种残留溶剂的保留时间、回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限见表1。

表1 14种残留溶剂的保留时间、线性方程、相关系数、线性范围、检出限及定量限Tab.1 Retention times，linear equations，correlation coefficient(r2)，Linearity ranges，LODs、LOQs of 14 residual solvents

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液

精密称取1 g(精确至0.01 g)的样品于10 mL容量瓶中，加DMF适量，密塞，振摇20 min，加0.4 mL内标溶液，用DMF稀释至刻度，摇匀，转移至15 mL聚乙烯离心管中，以8 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm有机滤膜供气相色谱仪分析。

2.2.2 对照品溶液

单个标准储备溶液的制备：分别精密称取0.2 g甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氢呋喃、异辛烷、正庚烷、二氧六环、甲苯、N,N-二异丙基乙胺、二氯甲烷、乙二醇、正丙醇于预置有1 mL DMF的20 mL容量瓶中，用DMF稀释至刻度、摇匀，备用。

混合标准储备溶液的制备：分别精密量取异辛烷、正庚烷、甲苯、N,N-二异丙基乙胺单个标准储备溶液2 mL；甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氧六环、乙二醇、二氯甲烷4 mL；二氯甲烷6 mL于100 mL容量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，备用。

内标溶液的制备：精密量取4 mL正丙醇标准储备溶液于100 mL容量瓶中，用DMF稀释至刻度，摇匀，备用。

混合标准工作溶液的制备：精密吸取混合对照储备液1 mL于50 mL的容量瓶中，加2 mL内标储备液，用DMF稀释、定容至刻度，摇匀，储存备用。

混合标准工作曲线溶液的制备：分别取混合标准储备溶液40 μL、100 μL、200 μL、400 μL、1 000 μL于10 mL容量瓶中，分别加入0.4 mL的内标溶液，用DMF稀释至刻度，摇匀，备用。

3 方法学验证

3.1 系统适用性试验

取混合标准工作溶液和空白溶剂，按2.1的色谱条件进行检测。结果表明：混合标准工作溶液中14种残留溶剂峰、内标峰及溶剂的色谱峰均能达到有效分离，峰形尖锐、对称性好(见图1、图2和表2)。

图1 溶剂色谱图Fig.1 Chromatogram of solvent

图2 混合标准工作溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed standard working solution

3.2 溶剂的选择

本试验比较了常用于残留溶剂分析的二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺2种溶剂，结果发现14种残留溶剂中异辛烷不溶于二甲基亚砜，而14种残留溶剂均溶于N,N-二甲基甲酰胺，因此选择N,N-二甲基甲酰胺作为溶剂，且溶剂中的杂质峰与相邻的色谱峰能达到有效分离，无干扰。

化合物保留时间(RT/min)理论塔板数(USP)分离度(USP)甲醇6.01551 448-乙醇8.49535 93517.1异丙醇10.53627 1197.5乙腈11.56343 9942.2二氯甲烷11.85741 8062.9甲基叔丁基醚13.13918 2414.4乙酸乙酯17.530123 4978.9四氢呋喃18.49275 3212.8异辛烷20.48951 8569.3正庚烷22.06377 1453.1二氧六环23.467892 6619.2甲苯24.4781 054 50914.1N,N-二异丙基乙胺25.480512 0415.9乙二醇26.5022 668 3391.5正丙醇(内标)15.52490 92910.7

3.3 内标物的选择

正丙醇与14种目标物的色谱峰无干扰、有效分离，方法的回收率和精密度也符合残留分析的要求[9]，因此选择正丙醇作为内标物。

3.4 色谱柱的选择

14种溶剂的极性差异较大，试验中对比了弱极性的HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)与中极性DB-624(75 m×0.53 mm×3 μm)色谱柱。结果表明，HP-5的分离度极差，且溶剂与14种目标物不能很好的分离，14种目标物之间也不能完全分离。因此，选择DB-624(75 m×0.53 mm×3 μm)具有较好的分离度，溶剂与目标物、目标物之间均能实现良好分离。

3.5 线性范围、相关系数、检出限及定量限

分别精密量取混合标准储备溶液40 μL、100 μL、200 μL、400 μL、1 000 μL于10 mL容量瓶中，分别加入0.4 mL的内标溶液，用DMF稀释至刻线，从低浓度向高浓度依次进样，记录色谱图(图3)。以质量浓度X(μg/mL)为横坐标，各个化合物峰面积/内标峰面积的比值Y为纵坐标计算线性回归方程，结果表明，各溶剂峰面积/内标，峰面积的比值线性关系良好(r2≥0.999 5)。按3倍的信噪比(3S/N)计算检出限，10倍信噪比(10S/N)计算定量限，14种残留溶剂的检出限为0.7～8.8 μg/mL，定量限为1.0～20.8 μg/mL(见表1)。

图3 乙二醇色谱图Fig.3 Chromatogram of Ethylene glycol

3.6 回收率与精密度

选取同一批次空白样品18份，添加3个水平2.04～ 48.85 μg/mL范围的标准溶液进行回收率实验，每个水平平行测试6次，计算回收率及相对标准偏差(RSD%)。结果表明：14种残留溶剂的平均回收率为73.6%～122.1%，RSD为0.4%～12.2%，结果满足《中国药典》四部通则0861 药品中常见的残留溶剂及限度和通则9101分析方法验证指导原则对回收率与精密度的要求[11]，见表3。

表3 14种残留溶剂的回收率及精密度结果(n=6)Tab.3 Spiked recoveries and relative standard deviation(RSDs) of 14 PAEs in Rape oil(n=6)

4 样品测定

按照本研究建立的方法对60批样品的14种残留溶剂的残留量进行测定，结果有1批样品中检出乙二醇，且含量低于定量限，残留量在允许范围内[9]。

5 结论

本研究建立了气相色谱法快速分析替格瑞洛片中14种残留溶剂的方法。优化的色谱条件可同时分离测定14种残留溶剂；方法的线性关系良好，r大于0.999 5；空白样品的加标回收率为73.6%～122.1%，RSD为0.4%～12.2%；定量限为1.0～20.8 μg/mL，可满足现有限量法规的检测要求。该方法具有灵敏度高、稳定性好、准确度高的优势，可为替格瑞洛及其制剂替格瑞洛片中14种残留溶剂的日常监控检测提供实用的技术手段。