黔产紫雀花药用成分地理变异研究

张 柯，蒋春燕，吴少雄，杨臣菊，余正文

(贵州师范大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

0 引言

紫雀花(Parochetuscommunis)又名金雀花、蓝雀花、生血草、一颗血，为蝶形花科紫雀花属草本植物[1]。生于2000 m左右海拔的山地和荒坡的阴凉、湿润处。主要分布于贵州毕节、普安、兴仁、遵义等地及四川、云南；印度、不丹、缅甸、斯里兰卡和泰国等也有少量分布。紫雀花为贵州苗族同胞常用草药，性味甘，微温，有补肾壮阳之效，用于治疗外感发热、肾虚阳痿、水肿和瘰疬[2-3]。课题组前期对紫雀花药材质量标准进行初步研究[4]，从紫雀花中分离鉴定得到芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素、车轴草醇、3′, 6-二甲氧基-5′-羟基异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿佛洛莫生-7-O-β-D-葡萄糖苷、β-谷甾醇、1-三十烷醇、 邻苯二酸二辛酯、邻苯二酸二丁酯、新植二烯，其中芒柄花素、芒柄花苷和美迪紫檀素3个异黄酮含量较高[5-6]。进一步对其不同部位进行清除自由基活性研究，其乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有显著的抗氧化活性，而芒柄花素和芒柄花苷并不是清除自由基的有效活性成分[7-8]。2020年Fumi Tatsuzawa从紫雀花中分离得到锦葵花素-3-O-鼠李糖苷、山奈酚3-O-(2-O-葡萄糖基-6-O-鼠李糖基)-葡萄糖苷和山奈酚3-O-(2，6-二-O-鼠李糖基)-葡萄糖苷[9]。芒柄花素和芒柄花苷是从黄芪、红车轴草、甘草、葛根、鸡血藤等中药材中提取的异黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、舒张血管、调节血脂代谢、抗病毒等多种药理活性[10-11]。美迪紫檀素具有抗菌、抗肿瘤活性[12-14]。药用植物的药效成分主要为次生代谢产物，其合成往往受到外因(环境因素)和内因(遗传因素)的共同影响。环境因素是影响药用植物次生代谢产物合成与积累的首要因素，而环境因素为光照、水分、温度、海拔等主要因素[15-16]。目前对于紫雀花的研究，主要集中在以芒柄花素为代表的质量标准研究、化学成分研究，尚未将化合物含量进行定量分析，且未将生态因子和化学成分相关联，探讨两者之间的关系。

为此，本研究测定了贵州省不同产地紫雀花中芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素的化合物含量，并关联海拔作相关性分析，阐明紫雀花3种药效成分含量之间以及与海拔之间的关系，为指导黔产紫雀花的野生资源保护、人工引种地理区划选择以及全面质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

Agilent1200高效液相色谱G1311A泵、G1315检测器、Agilent色谱工作站均来自于Agilent；MS105DU电子天平(梅特勒-托利多集团)；DK-1500D数码超声波清洗机(得康洗净电器有限公司)。

1.1.2 试剂

甲醇(德国默克 merck)；磷酸(天津市大茂化学试剂厂)；芒柄花素(批号：111703-200602纯度≥97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；芒柄花苷(自制，纯度≥97%)；美迪紫檀素(自制，纯度≥98%)；磷酸为分析纯，水为超纯水。

1.1.3 材料

样品来源于贵州省黔西南州和毕节市，采集新鲜叶片，晒干，并记录采集地海拔，见表1。经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为蝶形花科紫雀花属植物紫雀花(Parochetuscommunis Buch.)，样品保存于贵州师范大学生命科学学院。

表1 采样点信息Tab.1 Information of sampling points

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

采用CAPCELL PAK C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：1 mL·min-1；波长：芒柄花苷和芒柄花素(254 nm)，美迪紫檀素(280 nm)。流动相：乙腈(A)-磷酸水溶液(0.1%)(B)；梯度洗脱：0～20 min，45% A；20～25 min，55% A。

1.2.2 供试品溶液

取不同产地样品粉末约0.2 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入10 mL甲醇，超声提取30 min，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤。

1.2.3 对照品溶液的制备

分别准确称取芒柄花苷0.46 mg、芒柄花素2.50 mg、美迪紫檀素2.75 mg置于25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分别依次取1 mL，2 mL，2 mL置于10 mL量瓶中，并用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液。

1.2.4 线性关系的考察

分别精密量取芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素混合储备液0.5 mL，1 mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL，10 mL，12 mL置于量瓶内，加甲醇定容至刻度，摇匀。精密吸取各系列浓度的对照品溶液各20.0 μL，按照“1.2.1”项下色谱条件测定，以各对照品质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得到芒柄花苷、芒柄花素及美迪紫檀素的回归方程和线性范围。

1.2.5 仪器精密度试验

精密吸取紫雀花供试品溶液20.0 μL，按“1.2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素的峰面积，计算RSD值。

1.2.6 稳定性试验

精密吸取紫雀花供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件测定0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h样品中芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素含量，记录色谱峰面积，计算机含量及其RSD。

1.2.7 重复性试验

取6份紫雀花粉末，按“1.2.2”项下方法制备同一样品6份，按“1.2.1”项色谱条件测定芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素，记录色谱峰面积，计算含量及其RSD值。

1.2.8 加样回收率试验

取已知含量的紫雀花粉末9份，每份约0.1 g，精密称定，分别置具塞三角瓶中，按照样品中含量的80%、100%、120%的加入“1.2.3”项下对照品溶液。按“1.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件测定，并记录峰面积，计算加样回收率。

1.2.9 样品含量测定

分别取不同产地紫雀花样品粉末3份，按“1.2.2”项下方法制备样品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。通过标准曲线计算出不同产地紫雀花中芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素的含量。

2 结果与分析

2.1 回归方程、相关系数以及线性范围

芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素的回归方程、相关系数以及线性范围(见表2)，结果表明芒柄花素、芒柄花苷和美迪紫檀素在一定质量浓度范围内，进样浓度与峰面积线性关系良好。

表2 芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素的回归方程、相关系数以及线性范围Tab.2 Regression equation, correlation coefficients and linear ranges of the formononetin, ononin, medicarpin

2.2 精密度实验结果

通过芒柄花素、芒柄花苷、美迪紫檀素的峰面积，计算RSD值分别为0.04，0.15，0.03，表明该方法下仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验结果

芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素在0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h内RSD值分别为0.16，0.24，0.04；表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4 重复性试验结果

通过6份紫雀花粉末含量测定计算的芒柄花苷、芒柄花素、和美迪紫檀素的RSD值分别为0.26，0.89，0.17；表明实验重复性良好。

2.5 加样回收率试验

所有样品的加样回收率均在90%以上，相对标准误差均小于5%(见表3)，表明本研究采用的样品处理方法合符实验要求。

表3 加样回收率试验结果Tab.3 Results of the sample recovery test

2.6 样品含量测定

不同产地紫雀花中芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素的含量。结果见图1和表4。

表4 不同产地紫雀花中芒柄花苷、芒柄花素、美迪紫檀素含量

图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

3 讨论

3.1 不同产地紫雀花3种成分的比较

对贵州10个产地紫雀花中3种药效成分进行含量测定，结果如图2所示，3种成分中美迪紫檀素含量最高，其次为芒柄花素、最低为芒柄花苷。此外，紫雀花3种药效成分均在10个产地中检出，且贵州省普安县青山镇海马庄村的3种成分均较高。

图2 不同产地紫雀花种3种化合物含量Fig.2 Contents of ononin, formononetin, medicarpin in Parochetus communis from different origin

3.2 紫雀花3种成分相关性分析

为了更好地研究紫雀花中3种药效成分含量之间的关系及其与采样地海拔之间的关系，对其进行了相关性分析。结果(如表5)表明，芒柄花素和芒柄花苷之间呈现极显著相关(P<0.01)，与美迪紫檀素显著相关(P<0.05)；芒柄花苷与美迪紫檀素显著相关(P<0.05)。3种药效成分均与紫雀花生长海拔呈负相关，表明高海拔不利于3种药效成分的代谢积累，其中芒柄花苷受紫雀花生长海拔的影响较大。

表5 紫雀花3种成分相关性分析Tab.5 Correlation analysis between three compounds of Parochetus communis

3.3 紫雀花中3种异黄酮化合物线性回归预测模型

基于表4中3个药效成分的含量结果，将芒柄花苷含量作为因变量，以上述相关性分析中显著相关的成分芒柄花素和美迪紫檀素为自变量，应用逐步回归法建立预测模型。经过逐步拟合，芒柄花素进入回归方程，形成最优模型，模型的判定系数R2为0.708，估计值的标准误差为0.242，Durbin-Watson检验统计量为1.448，表明残差独立。逐步回归拟合的线性方程结果表明芒柄花素对芒柄花苷的影响可达到67.2%。因此，基于芒柄花素含量(X)与芒柄花苷含量(Y)，构建的线性回归模型为Y=0.482X+0.002。参数经t检验，其概率P值为0.002，具有显著性。表明，芒柄花苷的含量会随着芒柄花素含量的增加而增加。

3.4 聚类分析

对贵州10个不同产地的紫雀花3种药效成分进行聚类分析，结果表明10个产地样品聚成两类，其中DG、HZ、WT、HCZ、QXG为一类，LHJ、BP、DT、DST、HMZ为一类。

本研究通过对10个产地紫雀花的3种化合物成分进行测定，并对其进行相关性分析。结果表明，不同产地的芒柄花素和芒柄花苷之间差异显著，且根据线性回归预测模型预测其呈线性关系。聚类分析发现，贵州省兴仁市新龙场镇冬瓜村、贵州省赫章县河镇乡恒底村、贵州省兴义市万屯镇万屯村、贵州省兴义市乌沙镇纳姑村、贵州省毕节市七星关区殷官屯村聚为一类；贵州省兴仁市雨樟镇龙头箐村 、贵州省兴仁市潘家庄镇粑铺村、贵州省兴仁市新龙场镇大屯村、贵州省普安县地瓜镇地瓜村、贵州省普安县青山镇海马庄村聚为一类(图3)。

图3 不同产地紫雀花聚类分析Fig.3 Cluster analysis of Parochetus communis from different origin

4 结论

大量研究表明，药用植物次生代谢产物的积累受到环境的胁迫，且即使是同一种植物，受到不同的环境胁迫亦会诱导形成和积累不同的次生代谢产物或其次生代谢产物含量差异明显。因此，不同产地的紫雀花中3种药效成分出现了含量差异性。紫雀花中3种药效成分中美迪紫檀素含量(0.23～1.2 mg/g)明显高于其他两种化合物，其含量也高于其他豆科植物中美迪紫檀素的含量，如鸡血藤中美迪紫檀素含量范围为0.065～0.585 mg/g[15]，黄芪中美迪紫檀素含量范围0.034～0.135 mg/g[16]，红芪中美迪紫檀素含量范围0.029～0.353 mg/g[17]。由此可见，由于美迪紫檀素具有抗真菌、细菌、抗肿瘤等药理活性[12-14]，其可以作为美迪紫檀素的重要来源药用植物。

相关性分析和线性回归分析表明芒柄花素和芒柄花苷之所以产生显著性关系的原因可能是在黄酮类化合物生物合成途径过程中，芒柄花素是芒柄花苷的生物合成前体，因此，当芒柄花素积累得越多的时候，则芒柄花苷也会随之增多。本研究初步分析紫雀花中3种药效成分与海拔之间的相关性关系，虽未呈现出显著相关性，但总体看来，高海拔均不利于3种药效成分的代谢积累，特别是芒柄花苷受海拔的影响较大，另据文献报道[2]，紫雀花多分布在海拔2 000 m左右地区，但本次调查采样发现，该植物在1 500 m左右海拔分布较广，为此，建议在新版的植物志或其他相关文献中将紫雀花的分布海拔修正为1 000 m以上比较合适。鉴于环境因子的多样性，将会进一步收集不同产地的气温、降水量、日照强度等因素做主成分分析及冗余分析，以明确影响紫雀花中药效成分含量的主要环境因子。