莪术油对宫颈癌患者血清中微小RNA表达和术后康复的影响※

朱琳妹,黄海明,高晓红,蒋春林

(1.广东祈福医院,广东 广州 511495；2.中山大学孙逸仙纪念医院,广东 广州 510120)

宫颈癌是仅次于乳腺癌的女性常见的恶性肿瘤,由于早期诊断困难,病死率较高,严重威胁女性健康。微小RNA(microRNA,miR)是一类分子量较小的非编码RNA,调控相关靶基因的蛋白表达和细胞增殖、凋亡及肿瘤转移、病毒感染等生物学过程[1]。检测组织或血清中miR的表达有助于宫颈癌的早期诊断和治疗[2]。而血清miR可长时间稳定地存活,检测便利,适用于动态监测[3]。本课题组在前期研究中采用高通量的基因芯片测序法,从宫颈癌患者血清中筛选出13个具有显著差异的miR,其中miR-106b、miR-21的表达显著升高,且表达量与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移显著相关。莪术具有行气破血、消积止痛的功效,其主要成分莪术油具有较好的抗宫颈癌作用,但是否通过miR途径发挥抗癌作用尚无证据[4]。本研究的目的是探讨莪术油对宫颈癌患者血清中miR表达和术后康复的影响,旨在阐明莪术油抗宫颈癌的作用及机制,为宫颈癌的早期诊断和治疗提供新的依据。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2020年1月至2021年3月广东祈福医院妇科收治的早期宫颈癌患者78例,采用随机数字表法分为对照组和干预组,每组39例。对照组年龄31～52岁,平均(42.7±9.7)岁；体质量指数为18.5～24.6 kg/m2,平均(22.6±2.2)kg/m2；国际妇产科协会(FIGO)肿瘤分期:ⅠA 5例,ⅠB 18例,ⅡA 16例；肿瘤大小:＞2 cm者24例,≤2 cm者15例；肿瘤浸润深度:＞1/2者14例,≤1/2者25例；肿瘤组织类型:鳞癌28例,腺癌8例,腺鳞癌3例；人类乳头瘤病毒(HPV)感染:阳性36例,阴性3例；盆腔淋巴结转移:阳性9例,阴性30例。干预组年龄33～56岁,平均(44.3±9.7)岁；体质量指数为18.8～25.1 kg/m2,平均(23.5±2.3)kg/m2；FIGO肿瘤分期:ⅠA 7例,ⅠB 14例,ⅡA 18例；肿瘤大小:＞2 cm者21例,≤2 cm者18例；肿瘤浸润深度:＞1/2者16例,≤1/2者23例；肿瘤组织类型:鳞癌31例,腺癌6例,腺鳞癌2例；HPV感染:阳性37例,阴性2例；盆腔淋巴结转移:阳性7例,阴性32例。两组患者一般资料比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。本研究经医院医学伦理委员会审查通过(伦理审批号:2/2020-19)。

1.2 诊断标准 ①西医诊断符合《妇产科学》中宫颈癌的相关诊断标准,宫颈刮片细胞学检查和宫颈组织活检均证实为宫颈癌[5]。②中医诊断符合肝肾阴虚、肝郁气滞、脾肾阳虚、湿毒蕴结、气血两虚等宫颈癌的辨证标准,阴道出血时多时少,带下量多、色白或米泔样、味腥臭,腰酸腿软,胸胁胀满,小腹胀痛,头晕目眩,疲乏无力,五心烦热,口干口苦,小便短赤,大便秘结,舌苔薄白或黄腻,舌红或有瘀斑,脉弦细[6-7]。

1.3 纳入标准 符合上述诊断标准,且初次诊断为宫颈癌；FIGO分期为ⅠA、ⅠB和ⅡA期,即早期宫颈癌；年龄为18～65岁；体质量指数为18.5～28.0 kg/m2；心功能1～2级；患者均签署知情同意书。

1.4 排除标准 复发性宫颈癌者；孕期及哺乳期者；长期接受糖皮质激素治疗者；合并严重心、肺、肝、肾等脏器疾病者；合并精神疾病者；对莪术油注射液过敏者。

2 治疗方法

2.1 干预措施 两组患者采用统一的手术治疗标准(具体内容见2.2),干预组于手术治疗前后分别静脉滴注莪术油注射液(浙江天瑞药业有限公司,国药准字H33022542,10 m L∶0.1 g)1个疗程(每日0.3 g,连续7 d),对照组于同一时间段静脉滴注等容量的0.9%氯化钠注射液。两组患者治疗前和治疗后各干预1个疗程(7 d)。

2.2 手术治疗方案 参照《2018NCCN宫颈癌临床实践指南(第1版)》[8],采用以下手术方案:ⅠA1期无淋巴脉管间隙浸润患者选择宫颈锥切术(有生育要求)或单纯子宫切除术(无生育要求)；ⅠA1期伴淋巴脉管间隙浸润和ⅠA2期,选择广泛性子宫切除术＋盆腔淋巴结切除术或前哨淋巴结显影；ⅠB和ⅡA期,选择广泛性宫颈切除术(有生育要求)或广泛性子宫切除术(无生育要求)＋盆腔淋巴结切除术＋前哨淋巴结显影；术中若发现高危因素(淋巴结阳性、切缘阳性和宫旁浸润),术后则加用辅助治疗(盆腔外照射＋顺铂同期化疗＋阴道近距离放疗)。

2.3 麻醉和镇痛方案 两组患者采用统一方案的气管内插管全身麻醉,术后采用统一的连续静脉镇痛方案,患者可以根据手术伤口的疼痛情况自行追加镇痛药物。

3 疗效观察

3.1 观察指标 ①血清miR-106b、miR-21表达。于患者入院时(t0)、莪术油滴注1个疗程后(t1)和莪术油滴注2个疗程后(t2),分别抽取外周静脉血3 m L,以2 500 r/min离心收集血浆。取血浆0.5 m L,使用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA,采用逆转录-定量聚合酶链反应(日本TaKaRa公司)扩增mRNA,应用2-ΔΔCt法分析 miR-106b和 miR-21的相对表达量,每组样本重复分析3次。以U6为内参,引物由上海生工生物公司合成,miR-106b的序列:正向5’-TTTTCGCCCTTAGCGTGAAGA-3’,反向5’-GAGGCAGTCGAAGCTCTCG-3’；miR-21的序列:正向5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’,反 向5’-CUAUACAACCUACUACCUCAUU-3’。②术后早期康复情况。比较两组患者的术后住院天数。采用术后各方面恢复评定量表(QoR-40)评估患者住院期间的康复质量评分,比较患者t0、t1、t2和出院时(t3)的Qo R-40评分。

3.2 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析,以双侧检验P＜0.05表示有统计学差异。计数资料用频数或百分比描述,采用卡方检验或精确概率法。计量资料用均数±标准差或四分位数描述,先进行正态性和方差齐性检验,满足要求者采用Student't检验,组内比较采用重复测量资料的方差分析,未满足要求者采用秩和检验。

样本量估算和随机分组:目前我院首选开腹广泛子宫切除术治疗早期宫颈癌,患者术后住院天数均值(标准差)为13.8(2.0)d。假设莪术油的应用能将术后住院时间缩短1 d,将检验水准α设为0.05,检验效能(1-β)设为80%,采用PASS软件检出差异每组需要的最少样本量为34例,两组共需68例。考虑15%的失访率,需纳入早期宫颈癌患者78例进入本研究。

3.3 结果

(1)血清miR-106b和miR-21相对表达量 莪术油滴注1个疗程(t1)后,干预组患者血清中miR-106b和miR-21的相对表达量均较t0下降(P＜0.05),而对照组无明显变化。滴注莪术油2个疗程(t2)后,两组患者血清miR-106b和miR-21的相对表达量均较t0、t1时下降(P＜0.05),且干预组低于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 两组宫颈癌患者不同时间点血清中miR-106b、miR-21的相对表达量比较(2-ΔΔCt法,±s)

表1 两组宫颈癌患者不同时间点血清中miR-106b、miR-21的相对表达量比较(2-ΔΔCt法,±s)

注:与本组入院时(t0)比较,△P＜0.05；与治疗1个疗程(t1)后比较,▲P＜0.05；与对照组同期比较,※P＜0.05。

指标 时间点 对照组 干预组miR-106b t0 4.3±1.9 4.2±1.7 t1 4.2±1.7 3.5±1.5△t2 2.6±1.1△▲ 1.9±0.9△▲※miR-21 t0 3.8±1.6 3.9±1.5 t1 3.8±1.3 3.2±1.3△t2 2.1±1.0△▲ 1.5±0.6△▲※

(2)术后住院时间及术后康复情况比较 干预组术后住院时间短于对照组(P＜0.05)。治疗2个疗程(t2)后,两组患者Qo R-40评分均较t0、t1、t3时下降,且干预组t2时的QoR-40评分高于同期对照组(P＜0.05)；其他时间点的QoR-40评分组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 两组宫颈癌患者术后住院时间及不同时间点康复情况比较(±s)

表2 两组宫颈癌患者术后住院时间及不同时间点康复情况比较(±s)

注:与本组入院时(t0)比较,△P＜0.05；与治疗1个疗程(t1)后比较,▲P＜0.05；与治疗2个疗程(t2)后比较,＃P＜0.05；与对照组同期比较,※P＜0.05。

指标 时间点 对照组 干预组术后住院时间(d) 13.3±2.2 11.9±1.9※QoR-40(分) t0 192.2±3.9 191.4±4.2 t1 192.9±4.1 193.8±4.0 t2 180.6±6.4△▲ 187.1±6.1△▲※t3 193.2±4.0＃ 194.5±4.2＃

4 讨论

宫颈癌占全球癌症发病率的12%[9],超过85%的宫颈癌新发病例发生在经济不发达地区,我国宫颈癌发病率是其他发展中国家的6倍[10]。宫颈癌如能早期治疗,可提高患者的生存率,但要早期诊断极为困难。因此,亟须找到一种灵敏度高、稳定性好、检测方便的标志物用于宫颈癌的早期诊断和预后判断。

miR是一类分子量较小的非编码RNA,检测miR的差异性已成为多种癌症早期诊断的有效手段,如miR-221用于诊断肝细胞癌,miR-320用于诊断前列腺癌[11-12]。笔者在前期研究中发现,宫颈癌患者血清中miR-106b和miR-21的表达量明显高于健康人群。

中医认为,宫颈癌属“崩漏”“癥瘕”“带下”“石瘕”等范畴,治疗以疏肝理气、健脾祛湿、温补肾阳为主[7]。莪术具有行气破血、消积止痛等功效。研究表明,莪术可通过以下机制发挥抗宫颈癌作用:引发宫颈癌CASKI细胞的G2/M期停滞,抑制其DNA合成和分裂,从而诱导CASKI细胞凋亡[13]；上调Bax促凋亡基因和下调Bcl-2抗凋亡基因,抑制其RNA的生物合成和诱导宫颈癌Hela细胞凋亡[14]；抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR)的表达,减少肿瘤血管的形成[15]。然而,莪术油是否通过干预miR的表达而发挥抗宫颈癌作用,目前尚没有证据。

本研究结果发现,宫颈癌患者血清中miR-106b和miR-21的表达量明显高于健康人群；静脉滴注莪术油1～2个疗程后可以降低血清中miR-106b和miR-21的相对表达量,同时可以缩短术后住院时间。QoR-40量表是从患者自我感受的角度出发,评估患者术后康复速度和质量,其与术后康复质量的相关性已得到广泛认可[16]。本研究结果发现,莪术油的应用可提高QoR-40评分,并通过miR途径发挥抗宫颈癌作用,加快术后康复,改善康复质量。另外,miR对RNA酶具有天然抗性,可稳定存在于血清、唾液等样本中,而血清miR在室温下可稳定24 h,反复冻融多次不降解,检测方便[17]。因此,检测血清中miR-106b和miR-21的相对表达量有助于宫颈癌的早期诊断、病情监测和预后判断,值得在临床上推广应用。