基于调控FGF23/Klotho信号通路分析益肾宁改善慢性肾脏病钙磷代谢紊乱的作用机制※

李 慧,李 红

(1.山西中医药大学,山西 太原 030024；2.山西中医药大学附属中西医结合医院,山西 太原 030024)

钙磷代谢紊乱是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)重要的临床特征之一,会引起矿物质及骨代谢异常,导致肾性骨病、多系统损害、心血管事件高发等。目前CKD钙磷代谢紊乱的主要治疗措施为降低血磷、调整血钙和处理继发性甲状旁腺功能亢进症[1],但尚缺乏有力的证据证明降磷治疗和限制饮食中磷的摄入可改善临床预后,以及磷结合剂在CKD 3～4期患者中使用的安全性和有效性、含磷结合剂的安全剂量范围、骨化三醇或拟钙剂的应用能使患者临床获益。本课题组前期研究和临床实践表明,益肾宁治疗CKD早期临床疗效较好,可明显改善肾间质纤维化,调节钙磷代谢紊乱[2]。近年来,成纤维细胞生长因子23(FGF23)/Klotho信号通路已成为CKD早期评估与治疗的靶标[3],但其对CKD钙磷代谢紊乱影响的研究较少。故本研究以FGF23/Klotho信号通路为切入点,探讨益肾宁通过调控FGF23/Klotho信号通路改善CKD钙磷代谢紊乱的作用机制,现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2020年1月至2021年1月就诊于山西中医药大学附属中西医结合医院肾病科的72例CKD 3期钙磷代谢紊乱患者,采用随机数字表法分为对照组和治疗组,每组36例。对照组男19例,女17例；平均年龄(43.94±7.68)岁；平均病程(3.27±0.25)年；原发病:慢性肾小球肾炎13例,高血压肾病10例,肾病综合征13例。治疗组男18例,女18例；平均年龄(44.53±5.59)岁；平均病程(3.43±0.12)年；原发病:慢性肾小球肾炎14例,高血压肾病9例,肾病综合征13例。两组患者一般资料比较,差异均无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会审查(伦理审批号:ZXY2022HY009)。

1.2 诊断标准 ①西医诊断标准。参考文献[4]诊断为钙磷代谢紊乱:血清磷＞1.45 mmol/L,血清钙≤2.10 mmol/L。参考文献[4]诊断为CKD 3期:肾小球滤过率(GFR)为30～59 m L/(min·1.73 m2)。②中医诊断标准。参考文献[5]相关标准辨证为肾浊瘀阻证,主症:倦怠乏力,腹胀纳差,腰膝酸软,夜尿清长；次症:关节筋骨疼痛,肢体麻木、抽搐,皮肤瘙痒,肌肤甲错,水肿,大便不成形或大便干结；舌苔脉象:舌质紫暗或淡红,苔腻,脉沉细涩。具备以上症状中的2项主症及1项次症及以上者,即可诊断。

1.3 纳入标准 年龄18～60岁；符合上述诊断标准；参与研究期间不接受其他方案治疗；患者自愿参加本研究,并签署知情同意书。

1.4 排除标准 无法遵守医嘱,依从性差者；合并肝、脑及造血系统等严重原发性疾病者；合并肿瘤、甲状腺功能亢进症、严重炎症等消耗性疾病者；在本研究前3个月内参与其他临床研究者。

2 治疗方法

2.1 对照组 给予纠正水电解质紊乱,调节血压,优质低蛋白、低磷饮食,口服碳酸钙片(珠海同源药业有限公司,国药准字H44024255,0.75 g/片)等常规治疗。碳酸钙片每次0.75 g,每日3次。治疗8周。

2.2 治疗组 在对照组治疗基础上给予益肾宁颗粒剂(由天江药业提供)口服。处方:黄芪、丹参、红花、积雪草、车前子各30 g,当归、川芎、何首乌各15 g,杜仲、猪苓、茯苓各12 g,桃仁、枳壳、清半夏、陈皮各10 g,制大黄9 g,甘草片、砂仁(后下)各6 g。每日1剂,早晚用开水冲服,治疗8周。

3 疗效观察

3.1 观察指标及疗效评定标准 ①临床疗效。根据主症的无、轻、中、重度分别计0、3、6、9分,根据次症的无、轻、中、重度分别计0、2、4、6分,舌苔、脉象不计分。显效:中医证候积分降低＞60%,血肌酐(SCr)降低≥20%,血钙(Ca)、血磷(P)、全段甲状旁腺激素(iPTH)至少有2项在目标范围之内；有效:中医证候积分降低30%～60%,SCr降低≥10%且＜20%,血Ca、血P、iPTH仅有1项在目标范围之内；无效:中医证候积分降低＜30%,SCr升高,血Ca、血P、iPTH均不在目标范围之内。总有效率＝(显效例数＋有效例数)/总例数×100%。②FGF23、Klotho蛋白及血Ca、血P、iPTH、SCr水平。比较两组治疗前、治疗4周和治疗8周的血清FGF23、Klotho蛋白及血Ca、血P、iPTH、SCr水平。血清FGF23、Klotho蛋白运用酶联免疫吸附试验法测定,样本及试剂于室温(18～25℃)下解冻至少30 min,加入100μL标准品溶液,再加入50μL酶标记溶液,封板模密封后在37℃下孵育1 h,弃去液体,酶洗5次,吸水纸透彻拍干,加入显色剂A 50μL和显色剂B 50μL,在18～25℃下避光反应10 min,加入终止液50μL,终止反应,用酶标仪(波长450 nm)依次测量各孔的吸光度(OD值)。血Ca、血P、SCr水平采用BECKMAN-C800全自动生化分析仪测定,iPTH采用放射免疫法测定。

3.2 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,组内比较采用配对t检验,组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验；计数资料用百分率(%)表示,采用χ2检验；相关分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

3.3 结果

(1)临床疗效比较 治疗组总有效率为80.56%(29/36),对照组总有效率为63.89%(23/36),两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 两组慢性肾脏病3期钙磷代谢紊乱患者临床疗效比较(例)

(2)FGF23、Klotho蛋白比较 治疗前,两组患者FGF23、Klotho蛋白水平比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。治疗4、8周,两组患者FGF23水平均较治疗前下降(P＜0.05),治疗组FGF23水平低于同期对照组(P＜0.05)；两组患者Klotho蛋白水平均较治疗前升高(P＜0.05),治疗组Klotho蛋白水平高于同期对照组(P＜0.05)。见表2。

表2 两组慢性肾脏病3期钙磷代谢紊乱患者治疗前后成纤维细胞生长因子23、Klotho蛋白水平比较(ng/mL,±s)

表2 两组慢性肾脏病3期钙磷代谢紊乱患者治疗前后成纤维细胞生长因子23、Klotho蛋白水平比较(ng/mL,±s)

注:与本组治疗前比较,△P＜0.05；与对照组治疗后同期比较,▲P＜0.05。

组别 例数 时间 成纤维细胞生长因子23 Klotho蛋白治疗组 36 治疗前 549.28±162.73 456.94±124.16治疗4周 502.84±92.47△▲ 530.84±98.47△▲治疗8周 456.82±75.64△▲ 580.82±80.64△▲对照组 36 治疗前 551.88±182.83 451.43±121.32治疗4周 521.97±104.3△ 491.97±104.32△治疗8周 503.54±84.72△ 520.54±84.72△

(3)血Ca、血P比较 治疗前,两组患者血Ca、血P水平比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。治疗4、8周,两组患者血Ca水平均较治疗前升高(P＜0.05),治疗组血Ca水平高于同期对照组(P＜0.05)；两组患者血P水平均较治疗前下降(P＜0.05),治疗组血P水平低于同期对照组(P＜0.05)。见表3。

表3 两组慢性肾脏病3期钙磷代谢紊乱患者治疗前后血钙、血磷水平比较(mmol/L,±s)

表3 两组慢性肾脏病3期钙磷代谢紊乱患者治疗前后血钙、血磷水平比较(mmol/L,±s)

注:与本组治疗前比较,△P＜0.05；与对照组治疗后同期比较,▲P＜0.05。

组别 例数 时间 血钙 血磷治疗组 36 治疗前 1.80±0.19 1.81±0.33治疗4周 2.13±0.13△▲ 1.42±0.35△▲治疗8周 2.31±0.24△▲ 1.22±0.24△▲对照组 36 治疗前 1.82±0.21 1.83±0.38治疗4周 1.90±0.16△ 1.67±0.36△治疗8周 2.17±0.29△ 1.46±0.39△

(4)iPTH、SCr比较 治疗前,两组患者iPTH、SCr水平比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。治疗4、8周,两组患者iPTH、SCr水平均较治疗前下降(P＜0.05),治疗组iPTH、SCr水平均低于同期对照组(P＜0.05)。见表4。

表4 两组慢性肾脏病3期钙磷代谢紊乱患者治疗前后甲状旁腺激素、血肌酐水平比较(±s,mmol/L)

表4 两组慢性肾脏病3期钙磷代谢紊乱患者治疗前后甲状旁腺激素、血肌酐水平比较(±s,mmol/L)

注:与本组治疗前比较,△P＜0.05；与对照组治疗后同期比较,▲P＜0.05。

组别 例数 时间 甲状旁腺激素 血肌酐治疗组 36 治疗前 298.88±162.73 131.07±26.23治疗4周 213.84±98.47△▲ 103.18±25.78△▲治疗8周 176.82±75.64△▲ 90.15±24.93△▲对照组 36 治疗前 309.45±153.69 130.19±28.17治疗4周 253.97±104.32△ 112.23±26.03△治疗8周 210.54±84.72△ 90.15±24.93△

(5)FGF23、Klotho蛋白与SCr、血Ca、血P、iPTH的相关性分析 FGF23与SCr、血P、iPTH呈正相关,与血Ca呈负相关；Klotho蛋白与SCr、血P、iPTH呈负相关,与血Ca呈正相关。见表5。

表5 成纤维细胞生长因子23、Klotho蛋白与血肌酐、血钙、血磷、全段甲状旁腺激素的相关性分析

4 讨论

中医认为,CKD钙磷代谢紊乱属于“虚劳”“骨痹”等范畴。本病发病之本在脾肾亏虚,肾为先天之本,藏先天之精气,主骨生髓,亦主脏腑气化,调控各脏腑形体官窍的功能；脾为后天之本,运化水谷精微而输布四傍。先后天相互资生,肾中精气不足,封藏失司,致骨不坚、髓不养和脏腑气化失常。肾病及脾,脾虚则运化失司,水谷精微不能滋养肾精,骨髓得不到充养,五脏失养致气血阴阳不足,周身乏力。发病之标为湿浊、瘀毒阻滞,脾制水,肾主水,脾肾衰惫,则水谷运化失司,输布不及,聚而成湿,湿邪停聚,困阻三焦,气机失常,日久化生湿浊、瘀毒等病理产物。湿浊、瘀毒阻滞气血运行,致不通则痛,表现为骨关节刺痛、胀痛；形体官窍失于荣养,致不荣则痛,表现为骨关节酸痛、空痛；浊毒流于皮肤,血燥生风,致皮肤瘙痒,总的病机为肾浊瘀阻。

FGF23主要由骨细胞和成骨细胞合成和分泌。有实验研究发现,FGF23基因缺陷小鼠表现为高钙血症、高磷血症、异位钙化、骨质疏松[6],FGF23基因过表达小鼠则表现为低磷血症、佝偻病、骨软化等[7]。FGF23主要通过其受体的介导及Klotho蛋白的协同作用以传达生物学信号[8]。Klotho基因具有抗纤维化、抗氧化、抗细胞凋亡、抗炎等多种效应[9]。Klotho主要表达于肾小管上皮细胞中,有研究发现,CKD患者肾脏Klotho mRNA及Klotho蛋白表达水平均显著下降,而Klotho蛋白缺乏可延缓肾脏修复,加重肾脏损伤[10]。Klotho基因编码的膜型α-Klotho蛋白是作为FGF23发挥生物活性的辅助因子。膜型α-Klotho蛋白通过与成纤维生长因子受体(FGFR)结合成为FGF23的跨膜协同受体以实现FGF23/Klotho信号传导[8],调节机体钙磷代谢。FGF23/Klotho信号通路作用于肾近曲小管上皮细胞,抑制近端肾小管钠-磷共向转运体的表达,抑制对磷的重吸收；通过抑制维生素D合成并促进其分解,使活性维生素D水平下降[11],以降低肠道对钙、磷的重吸收；也可直接抑制甲状旁腺激素(PTH)的表达与分泌,然而CKD患者的低钙高磷的内环境状态持续刺激PTH的分泌,iPTH水平仍升高[12]。随着CKD的进展,GFR持续下降,肾脏适应机制不足以维持磷摄取和排泄平衡,血P升高,FGF23持续上升,Klotho蛋白不能满足逐步上升的FGF23所需要的结合位点,导致FGF23抵抗发生[13],使FGF23/Klotho信号通路失去对钙磷代谢的有效调节。

益肾宁为山西中医药大学附属中西医结合医院肾病科常用方剂。方中黄芪有补气升阳、利尿消肿、生津养血之功。药理研究显示,黄芪能抑制CKD大鼠FGF23过高表达,上调Klotho蛋白表达,改善钙磷代谢,延缓CKD大鼠肾功能损伤进展[14]。首乌、杜仲补益肝肾,益精填髓。陈皮、清半夏、茯苓、甘草有燥湿化痰、理气和中之功,加砂仁、枳壳可增其行滞宽中之力。大黄通腑泄浊逐瘀,猪苓、车前子利水渗湿泄浊,使邪有出路。桃仁、红花、川芎、当归为桃红四物汤加减,可滋补营血,补中寓行。丹参凉血活血,使瘀而不热。积雪草清热利湿,解毒消肿,研究证实其能抑制系膜细胞增殖及肾小球硬化,发挥抗炎、抗氧化、改善微循环、保护肾功能等多重作用[15]。诸药合用,共奏补肾健脾、利湿排浊、解毒活血之功。

本研究结果显示,益肾宁可提高临床疗效,升高Klotho蛋白、血Ca水平,降低FGF23、血P、iPTH、SCr水平,FGF23与血Ca呈负相关,与血P呈正相关,Klotho蛋白与血Ca呈正相关,与血P、PTH呈负相关,FGF23与Klotho呈负相关,表明益肾宁能改善CKD患者的临床症状及肾功能,并通过调控FGF23/Klotho信号通路以改善钙磷代谢紊乱,为临床治疗本病提供了新的思路与方法。