鸡肉中三种喹诺酮药物残留检测的 不确定度评定

◎ 张丹鹤，周莹莹，刘定舟，朱欣欣，崔倩倩，贾松涛，赵林萍

（1.河南中标检测服务有限公司，河南 郑州 450001；2.郑州中道生物技术有限公司，河南 郑州 450001）

喹诺酮类，又称吡酮酸类，是一类合成抗菌药。因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、组织穿透力强、价格低廉以及与其他抗菌药物无交叉耐药性等特点，被广泛应用于畜禽多种疾病的预防和治疗[1]。恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星是家禽养殖中的常用药，使用率较高[2]。但是，如果在畜禽养殖过程中不合理用药，或者未严格按照休药期用药，易导致畜禽产品的药物残留超标，对人类健康带来安全隐患。在农产品质量安全监管中，不确定度显得极为重要，尤其是当检测结果处于限量附近时，通过方法的不确定度的评估，可以对检测结果的准确性进行评价，以验证样品是否合格[3]。本研究对实验室应用《食品安全国家标准 动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 31658.17—2021）测定鸡肉中恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星含量进行了不确定度分析，找出影响结果的主要分量，在实际操作中对这些分量进行重点控制，有利于在兽药残留检测工作中对检测结果作出更准确的判定。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Thermo Fisher TSQ Quantis/Vanquish超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；20～200 μL移液枪，100～1 000 μL移液枪（Dragon）；0.000 01 g感量分析天平（美国奥豪斯Ohaus）；0.01 g感量分析天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；50 mL容量瓶。

1.2 材料与试剂

标准物质：恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星，均由Dr. Ehrenstorfer GmbH生产；甲醇、乙腈、甲酸，均为色谱纯，由Thermo Fisher公司生产；其他试剂均为分析纯；实验用水为一级水。

标准储备液配制：用十万分之一天平称量5 mg的标准物质，用0.03 mol·L-1氢氧化钠溶液溶解并定容至50 mL，配制成浓度为100 μg·mL-1的标准溶液。

1 μg·mL-1混合标准工作液的配制：分别用移液器取0.1 mL浓度为100 μg·mL-1的标准储备液，于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

0.1 μg·mL-1混合标准工作液的配制：用移液器取1 mL浓度为1 μg·mL-1的混合标准工作液，于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

1.3 样品处理

提取净化：称取试样1 g（准确至±0.01 g），按照GB 31658.17—2021的测定步骤进行处理，收集洗脱液，45 ℃水浴氮气吹干。加入复溶液1.0 mL，涡旋1 min溶解残余物，14 000 r·min-1离心5 min，过0.22 μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定[4]。

1.4 标准曲线溶液的制备

精密量取混合标准工作溶液适量，分别加入7份经提取和净化的空白试样残渣中，45 ℃水浴氮气吹干，加入复溶液1.0 mL涡旋溶解残余物，配制成浓度为 2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、 50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的基质匹配系列混合标准溶液，0.22 μm滤膜过滤。

1.5 样品测定

将配制的基质匹配标准曲线和样品溶液，用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪进行测定。以基质匹配标准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，求回归方程和相关系数，用外标法计算试样中药物的残留量。计算公式如下：

式中：C为测定样液中被测组分的浓度，ng·mL-1；V为定容体积，mL；m为样品重量，g；X为样品中待测组分的含量，μg·kg-1；f为稀释倍数。

1.6 数学模型的建立

根据上述结果计算公式，在实验过程中f为1，是一个常数，因此不确定度评定中此参数可忽略不计。由于实验过程步骤多，包括提取和净化等多个步骤，很难对各环节进行评定，具有不可控性，可通过加标回收率等对处理样品过程中的不确定度进行评定。综合得到鸡肉中3种喹诺酮类药物（恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星）的质量分数计算的不确定度评定数学模型如下：

式中：X为试样中药物残留量的数值，μg·kg-1；C为样品溶液中被测组分的浓度，μg·mL-1；m为样品重量，g；V为试样中最终定容体积的数值，mL；Rrec为回收率校正因子。

2 结果与分析

2.1 不确定度分量的主要来源分析

根据实验过程及数学模型分析，3种喹诺酮类药物（恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星）残留测定的不确定度主要来源于样品称量、样品溶液中被测组分的浓度、最终定容体积和样品前处理过程（通过加标回收率来反映）等。被测组分的浓度受标准储备液、标准曲线配制、校准曲线拟合等的影响较大。下面以恩诺沙星为例计算测量不确定度，然后以同样方法计算环丙沙星、沙拉沙星的测量不确定度。

2.2 样品称量引入的相对标准不确定度urel(m)

本实验中称量样品1.00 g，所用天平精密度为0.01 g。校准证书给出的扩展不确定度U1=0.01 g，k=2。标准不确定度=0.01/2=0.005 g，相对不确定度urel(m)=0.005/1=0.005。

2.3 标准储备液配制引入的相对标准不确定度urel(b)

主要由标准物质的纯度、标准物质称量和标准储备液定容过程引入。

2.3.1 标准物质纯度引入的相对标准不确定度urel(p)

3种喹诺酮类标准物质的纯度、不确定度和包含因子见表1。标准物质证书给出的是扩展不确定度，属于正态分布，置信概率P=95%，包含因子k=2，是B类评定，标准物质引入的相对标准不确定度为：

根据上述计算公式，求得环丙沙星的相对不确定度为0.007 10，沙拉沙星的相对标准不确定度为0.010 30。

表1 3种标准物质的来源、纯度及扩展不确定度表

2.3.2 标准物质称量引入的相对标准不确定度

标准储备液配制时，恩诺沙星称取5.01 mg，环丙沙星称取5.42 mg，沙拉沙星称取5.15 mg。十万分之一天平校准证书给出的扩展不确定度U2=0.05 mg，k=2，是B类评定。以恩诺沙星为例，标准不确定度，相对标准不确定度。

根据上述计算公式可得，环丙沙星标准物质称量时引入的相对标准不确定度为0.004 61，沙拉沙星标准物质称量时引入的相对标准不确定度为0.004 85。

2.3.3 标准储备液定容引入的相对标准不确定度

根据《标准玻璃量器检定规程》（JJG 20—2001）[5]， 50 mL A级容量瓶的允许误差为±0.016 mL， 容量瓶引入的不确定度为B类不确定度，符合矩形分布，包含因子，标准不确定度，容量瓶体积引入的相对标准不确定度。

储备液配制过程中所用的溶剂为0.03 mol·L-1氢氧化钠水溶液，水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃-1[6]。 容量瓶在20 ℃校准，实验室温度范围为（20±3）℃，水的温差效应引起的体积变化为50 mL×3 ℃×2.1× 10-4℃-1=0.031 5 mL，温度导致体积变化符合矩形分布，温度对体积影响引入的标准不确定度0.018 2，相对标准不确定度=0.000 364。

2.3.4 计算合成相对标准不确定度

以恩诺沙星为例，标准储备液配制过程引入的相对标准不确定度：

经计算，环丙沙星标准储备液配制引入的不确定度为0.008 48，沙拉沙星标准储备液配制引入的不确定度为0.011 40。

2.4 标准曲线引入的不确定度

2.4.1 移液器使用引入的不确定度

根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）[7]，用200 μL移液器移取200 μL的允许误差是±3.0 μL，移取100 μL的允许误差是±2.0 μL，移取20 μL的允许误差是±0.8 μL。因标准中未规定50 μL的允许误差，移取50 μL的允许误差取最大容量允许误差±4%计算，为±2.0 μL。

以200 μL移液器吸取100 μL溶液为例计算移液器引入的不确定度，允许误差是±2.0 μL，取均匀分布，标准不确定度，引入的相对不确定度urel(vy1)=1.15/100=0.011 5，由此计算方法得到200 μL移液器移取其他体积的不确定度urel(vx)，见表2。

表2 200 μL移液器引入不确定度表

2.4.2 混合标准工作液配制过程引入的不确定度

（1）1 μg·mL-1混合标准工作液配制过程中引入的不确定度。10 mL A级容量瓶的允许误差为±0.006 mL，容量瓶引入的不确定度为B类不确定度，符合矩形分布，包含因子，标准不确定度，容量瓶体积引入的相对标准不确定度。标准工作液配制过程中所用的溶剂为甲醇，甲醇的膨胀系数为1.1×10-3℃-1。容量瓶在20 ℃校准，实验室温度范围为（20±3）℃，甲醇的温差效应引起的体积变化为10 mL×3 ℃×1.1×10-3℃-1=0.033 mL，温度导致体积变化符合矩形分布，温度对体积影响引入的标准不确定度，相对标准不确定度。根据表2，200 μL移液器吸取100 μL标准储备液引入的不确定度为0.011 5， 则1 μg·mL-1混合标准工作液配制过程中引入的不确定度为：

（2）0.1 μg·mL-1混合标准工作液配制过程中引入的不确定度。根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）[7]，用1 000 μL移液器移取1 000 μL的允许误差是±10 μL，相对不确定度=0.005 77。参照1 μg·mL-1混合标准工作液不确定度评定分析过程，经计算得到0.1 μg·mL-1混合标准工作液配制过程中引入的相对标准不确定度为urel(b2)=0.006 09。

2.4.3 标准曲线溶液配制的不确定度urel(L)

标准曲线各浓度点配制的不确定度由所用混合标准工作液、移液器吸取一定体积的标准工作液以及用移液器吸取1 mL定容引入。吸取标准溶液时移液枪的使用过程见表3。以100 ng·mL-1浓度点的配制过程为例，相对不确定度：

按照此分析方法，经计算得200 ng·mL-1、50 ng·mL-1、20 ng·mL-1、10 ng·mL-1、5 ng·mL-1和2 ng·mL-1的不确定度分别为0.015 7、0.026 5、0.012 1、0.014 2、0.024 6 和0.024 6，计算时取标准曲线溶液的最大不确定度 值0.026 5。

表3 标准曲线配制过程表

2.4.4 线性拟合引入的不确定度

将标准溶液分别注入液相色谱串联质谱仪进行测定，进样量为5 μL，得到恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星标准曲线线性回归相关系数R2分别为0.999 6、0.999 3、0.999 9，因此线性拟合引起的不确定度可以不做考虑。

2.5 样品复溶定容引起的不确定度

提取过程中，氮气吹干后，最后用1 mL移液枪吸取1 mL复溶液复溶。用1 000 μL移液器移取1 000 μL 的允许误差是±10 μL，按矩形分布计算，量取1 mL复溶液的相对标准不确定度为：

2.6 处理样品过程中的不确定度

样品前处理过程的不确定度通过添加样的回收率和精密度进行评定，属于A类评定[8]。取鸡肉空白基质，加入适量混合标准溶液，得到含量为20 μg·kg-1（与测试样品浓度相当）的空白加标鸡肉样品，每个浓度6个平行，按照实验方法进行处理。6次测定的回收率、回收率的标准偏差见表4。恩诺沙星的相对标准不确定度。经计算可得环丙沙星和沙拉沙星的相对标准不确定度分别为0.020 7、0.029 1。

表4 添加样回收率及其标准偏差表

2.7 合成相对标准不确定度的计算

合成相对标准不确定度计算公式为：

各检测项目的相对标准不确定度结果见表5。

表5 各检测项目合成相对标准不确定度表

2.8 报告结果与表示

报告中鸡肉中恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星测定结果X测分别为20.40 μg·kg-1、17.80 μg·kg-1、18.90 μg·kg-1。

u(X)=urel(X)×X，取包含因子k=2，扩展不确定度U=k×u(X)，k=2，测定结果为X=X±U，k=2，具体结果见表6。

表6 各项目最终结果表

3 结论

分析各不确定度分量的评定数据可以得出，在实验室按照《食品安全国家标准 动物性食品中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB 31658.17—2021）测定鸡肉中恩诺沙星、环丙沙星和沙拉沙星含量时，影响不确定度的主要环节是标准储备液配制、标准曲线和回收率。在日常检测工作中，需要重视这些环节，使用高纯度标准物质，保证标准溶液的准确度，尽量将回收率控制在较高水平。在标准溶液配制过程中，相较容量瓶，使用移液器引入的不确定度较大。因此，实验室要定期对移液器进行校准，必须要正确操作、定期维护，保证移液器的准确。