生发片HPLC-DAD指纹图谱及指标性成分定量研究

司徒文辉，谢诗婷，刘颖，王永刚，彭维，姚宏亮，3*（.中山大学生命科学学院，广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东省热带亚热带植物资源与利用重点实验室，广州 5075；.广西南宁百会药业集团有限公司，南宁 53003；3.广东省科学院动物研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广东省野生动物保护与利用公共实验室，广州 5060）

生发片收载于《中药成方制剂》第十七册，由何首乌、女贞子、黑豆、黑枣、墨旱莲、麦冬、牡丹皮、桑椹、地黄、山药、茯苓、泽泻12 味中药组成[1]。具有滋补肝肾、益气养血、生发乌发的功效，用于肝肾不足、气血亏虚所致的头发早白，脱落，斑秃，全秃，脂溢性脱发。

中药成分复杂，生发片现行质量标准中仅对何首乌进行了定性和定量检测，不能确保生发片的安全性、有效性和均一性。目前对生发片质量研究较少，黄蓓蓓[2]曾建立生发片中总黄酮含量测定方法；曲珍仪等[3]用薄层鉴别对生发片中何首乌、墨旱莲、麦冬、地黄4 种药材进行鉴别，用高效液相色谱法（HPLC）测定二苯乙烯苷、特女贞苷含量[4]。指纹图谱具有整体性和模糊性的特点，是中药质量控制有效手段，能很好地评价和控制中药材及复方的质量[5-7]，目前未有生发片指纹图谱的文献报道。

本研究采用HPLC 法构建了生发片指纹图谱，同时测定了二苯乙烯苷、大豆苷、特女贞苷的含量，为完善生发片的质量控制方法提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

十万分之一电子分析天平（MS105DU，瑞士Mettler toledo 公司）；万分之一电子分析天平（ME 204，瑞士Mettler toledo 公司）；超纯水器（arium mini，德国Sartorius 公司）；数控超声波清洗器（KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司）；Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Dionex Ultimate 3000 高效液相色谱仪（美国Dionex 公司）；UFLC-Triple-TOF-MS/MS 超快速高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪（日本岛津公司）；Triple TOF 5600 plus（美国AB SCIEX 公司）。

1.2 试药

2，3，5 ，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批号：110844-201713，纯度：93.6%）、特女贞苷（批号：111926-201605，纯度：93.3%）、大豆苷（批号：111738-201603，纯度：93.3%）、芍药苷（批号：110736-201438，纯度：96.4%）对照品（中国食品药品检定研究院）。何首乌（批号：120934-201410）、 女贞子（批号：121041-201404）、黑豆（批号：120975-201406）、墨旱莲（批号：120958-201407）、牡丹皮（批号：121490-201102）、 地黄（批号：121180-201506）、 茯苓（批号：121117-201509）、泽泻（批号：121081-201406）、山药（批号：121137-201606）、麦冬（批号：121013-201310）、大枣（批号：121040-201408）（对照药材，中国食品药品检定研究院）。甲醇（广州化学试剂厂，批号：20180801，分析纯）；甲醇（Honeywell，批号：Q8AG1H，色谱级）；磷酸（阿拉丁，批号：G1614094，色谱级）；水为超纯水；28 批生发片均由广西南宁百会药业集团有限公司提供，编号为S1 ～S20 的生发片作为研究集建立对照指纹图谱；另8 批（S21 ～S28）生发片作为检验集与对照指纹图谱比较，具体见表1。

表1 生发片供试品批号Tab 1 Lot numbers of Shengfa tablets

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别称取2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大豆苷、特女贞苷、芍药苷适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 mL 含2，3，5，4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷35 μg、大豆苷10 μg、特女贞苷85 μg、芍药苷50 μg 的混合对照品溶液。

2.1.2 对照药材溶液的制备 分别取何首乌、女贞子、黑豆、墨旱莲、牡丹皮、地黄、茯苓、泽泻、麦冬、大枣和黑豆对照药材各0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取生发片20 片，去糖衣，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45 μm 滤膜，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性样品溶液的制备 按处方比例及工艺制备缺何首乌、女贞子、黑豆的阴性样品，并按“2.1.3”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.2 分析条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0 ～105 min，5% ～60%A）；流速：1 mL·min－1；进样量：10 μL；柱温：25℃；指纹图谱检测波长：227 nm；含量测定检测波长：250 nm（大豆苷）、320 nm（二苯乙烯苷）、227 nm（特女贞苷）。

2.2.2 质谱条件 ESI 电喷雾离子源，离子喷雾电压负模式－4500 V；喷雾气55 psi；辅助加热器55 psi；离子源温度550 ℃；气帘气35 psi；碰撞气压力10 psi，扫描范围m/z100 ～2000，采用负离子模式进行检测。

2.3 生发片指纹图谱的构建

2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液（批号：1801003），连续进样6 次。以6 号峰为参照，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.030%～0.17%，0.86%～4.6%。结果表明仪器的精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取供试品溶液（批号：1801003）， 分别在0、2、8、24、26、48 h 进样测定。以6 号峰为参照，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.030%～0.42%，0.38%～3.3%。结果表明供试品溶液放置48 h 稳定。

2.3.3 重复性试验 取同一批供试品（批号：1801003），按“2.1.3”项下方法分别制备6 份供试品溶液，进样检测。以6 号峰为参照，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.020%～0.10%，0.60%～3.8%。结果表明该方法重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的构建及相似度分析 取20 批（S1 ～S20）生发片，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012 版进行评价。20 批生发片的色谱图中有10 个共有峰稳定重现，编号为1 ～10。对20 批生发片HPLC 指纹图谱数据进行处理，建立叠加色谱图（见图1），通过中位数法获得生发片HPLC 对照指纹图谱（见图2）。

图1 20 批生发片HPLC 指纹图谱Fig 1 HPLC fingerprint of 20 batches Shengfa tablets

图2 生发片HPLC 对照指纹图谱Fig 2 HPLC control fingerprint of Shengfa tablets

以6 号峰（二苯乙烯苷）作为参照峰，计算10 个共有峰的相对保留时间，分别为0.19、0.33、0.77、0.87、0.94、1.00、1.03、1.12、1.47、1.51，各共有峰相对保留时间RSD在0.05%～1.2%。20 批生发片的相似度均大于0.95，结果见表2，表明不同批次生发片质量稳定。

表2 20 批生发片相似度评价结果Tab 2 Similarity of 20 batches of Shengfa tablets

2.3.5 共有峰的指证及药味归属分析 精密吸取对照药材溶液以及供试品溶液，进样检测，记录色谱图，通过保留时间、光谱图数据对比，得到10 个共有峰的归属，见图3。

图3 生发片指纹图谱共有峰归属性Fig 3 Attribution peak fingerprint of characteristic peak of Shengfa tablets

通过UFLC-Triple TOF-MS/MS 技术手段，按“2.2.2”项下质谱条件对对照品溶液、供试品溶液及对照药材溶液进行检测。通过对照品对照确证了其中4 个共有峰。通过保留时间、质谱分析及文献查询，指认1 号峰为没食子酸[8]，2 号峰为原儿茶酸[9-10]，5、10 号峰为单帖苷类化合物[11]，7 号峰为异黄酮类化合物[12]，9 号峰为裂环环烯醚萜类化合物[13]，共有峰的药味归属分析结果见表3。

表3 生发片共有峰指证及药味归属Tab 3 Identification and origin assignment of characteristic peaks in HPLC fingerprint

2.3.6 生发片指纹图谱的验证 对8 批生发片（S21 ～S28）进行测定，所得生发片HPLC-DAD指纹图谱如图4 所示，其中R 为对照指纹图谱。对8 批生发片指纹图谱与生发片HPLC 对照指纹图谱进行相似度评价，结果见表4。2 批超出有效期的生发片与对照指纹图谱的相似度低于0.90；6 批有效期内的生发片相似度均大于 0.95。

表4 8 批生发片验证相似度评价结果Tab 4 Similarity of HPLC fingerprint of 8 batches of Shengfa tablets

图4 8 批生发片HPLC 指纹图谱验证Fig 4 Validation of HPLC fingerprint of 8 batches of Shengfa tablets

2.4 指纹图谱同时对指标成分进行含量测定

2.4.1 系统适用性试验 分别吸取对照品溶液及供试品溶液进样测定，理论塔板数按特女贞苷计算应不低于30 000；结果二苯乙烯苷、特女贞苷和大豆苷均与其他组分达到基线分离，分离度大于1.5。

2.4.2 专属性考察 分别吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液、对照药材溶液各10 μL，进样测定，在供试品色谱图中呈现出与对照品二苯乙烯苷、特女贞苷、大豆苷及其对应对照药材色谱峰保留时间相同的色谱峰，阴性样品无干扰，具有良好专属性，结果见图5 ～7。

图5 二苯乙烯苷含量测定专属性试验（320 nm）Fig 5 Specificity test for determination of stilbene glycoside（320 nm）

图6 特女贞苷含量测定专属性试验（227 nm）Fig 6 Specificity test for determination of specnuezhenide（227 nm）

图7 大豆苷含量测定专属性试验（250 nm）Fig 7 Specificity test of daidzin content determination（250 nm）

2.4.3 线性关系考察 分别取二苯乙烯苷、特女贞苷和大豆苷对照品适量，加甲醇配制成含二苯乙烯苷对照品1.68、3.35、6.70、16.75、23.45、33.50 μg·mL－1，含特女贞苷对照品4.36、8.71、17.42、43.55、60.97、87.10 μg·mL－1， 含大豆苷对照品0.56、1.13、2.26、5.65、7.91、11.30 μg·mL－1系列溶液；按“2.2.1”项下色谱条件测定，以峰面积积分值A与进样质量浓度C（μg·mL－1）进行回归分析，3 种成分在各自的浓度范围内，进样质量浓度C（μg·mL－1）与峰面积A值呈良好线性关系，见表5。

表5 3 种成分的线性关系Tab 5 Linearity of the 3 components

2.4.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6 次，结果3 个对照品峰面积的RSD分别为0.94%、0.91%和0.94%，表明该方法精密度良好。

2.4.5 稳定性试验 取混合对照品溶液、供试品溶液，放置0、2、8、24、26、48 h 后进样测定，结果供试品溶液与对照品溶液中二苯乙烯苷峰面积的RSD分别为1.6%、0.76%，特女贞苷峰面积的RSD分别为1.4%、0.73%，大豆苷峰面积的RSD分别为1.6%、0.83%。表明生发片供试品溶液及混合对照品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.4.6 重复性试验 取同一批号（批号：1801003）生发片样品适量，按“2.1.3”项下方法平行制备6 份，进样测定。结果供试品中二苯乙烯苷、特女贞苷、大豆苷的平均含量分别为0.3652、0.7442、0.1459 mg·g－1，RSD值分别为0.46%、0.88%、0.91%。表明该方法重复性良好。

2.4.7 加样回收试验 精密称取已知含量的生发片适量，平行6 份，分别精密加入适量的二苯乙烯苷、特女贞苷、大豆苷对照品，进样测定，结果供试品中二苯乙烯苷、特女贞苷和大豆苷的平均回收率分别为92.85%、99.13%、98.21%，RSD分别为2.5%、2.2%、2.2%。表明该方法回收率好。

2.4.8 样品测定 取28 批生发片样品，分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，用外标法计算二苯乙烯苷、特女贞苷和大豆苷的含量，结果见表6。

表6 生发片的含量测定结果(mg/片)Tab 6 Content determination of Shengfa tablets (mg/tablet)

3 讨论

3.1 流动相的选择

通过比较乙腈-0.2%甲酸、甲醇-0.2%甲酸、甲醇-0.1%磷酸等流动相，发现甲醇-0.1%磷酸作为流动相时，各色谱峰分离度较好，基线较平，故选择甲醇-0.1%磷酸作为流动相。

3.2 检测波长的选择

采用DAD 检测器测定，二苯乙烯苷、特女贞苷和大豆苷最大吸收波长分别为318.87、227.23、250.91 nm；在2020年版《中国药典》一部何首乌药材【含量测定】中二苯乙烯苷选择320 nm 为检测波长。因3 个色谱峰的保留时间比较接近，不能用切换波长的方法对3 个图谱进行合并，且为保证含量测定的准确度，故选用成分最大吸收波长作为含量测定检测波长，即在320 nm 下检测二苯乙烯苷含量，227 nm、250 nm 分别检测特女贞苷与大豆苷含量。

3.3 含量测定指标成分的确定

用混合对照品确证了3 号峰芍药苷、4 号峰大豆苷、6 号峰二苯乙烯苷和8 号峰特女贞苷，结合4 个峰的分离度、不对称性、专属性、耐用性等因素；综合考虑，暂不把芍药苷成分列入含量测定的检测指标。

3.4 指纹图谱验证

2 批超出有效期的生发片为不合格样品，与对照指纹图谱的相似度低于 0.90。在后续含量测定时发现，过期生发片中二苯乙烯苷含量均低于有效期内的生发片；推测生发片过期后会有部分化学成分降解，所以相似度低于0.90。

4 结论

本研究建立了生发片HPLC 指纹图谱，确定了10 个共有峰，并利用对照品和HPLC-MS 技术对这10 个共有峰进行了确证和指认，确认它们是何首乌、女贞子、黑豆、牡丹皮、墨旱莲5 味药材的活性成分。在此基础上，对何首乌、女贞子、黑豆的指标性成分二苯乙烯苷、特女贞苷、大豆苷进行含量测定，全面有效地评价生发片的质量。经过方法学验证，表明所建立的检测方法操作简便、稳定、重复性良好，可为生发片的质量评价提供参考。