高效液相色谱法测定延龄草中4种甾体皂苷的油水分配系数及平衡溶解度

左月明，陈林林，张忠立（江西中医药大学，南昌 330004）

延龄草为百合科植物延龄草（Trillium tschonoskiiMaxim.）的根及根茎，俗称“地珠”，味甘、性平，有小毒，具有镇静止痛、活血止血之功效，主治头晕目眩、跌打损伤、神经衰弱、脑震荡后遗症等疾病，是恩施土家族著名的民间药[1]。延龄草的主要活性成分为甾体皂苷，以4种甾体皂苷偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（简称Y1T）、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1 →2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（简称Y2T）、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1 →4）-[α-L-吡喃鼠李糖基（1 →2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷（简称Y3T）、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1 →4）-α-L-吡喃鼠李糖基（1 →4）-[α-L-吡喃鼠李糖基（1 →2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷（简称Y4T）为主。现代药理研究表明，甾体皂苷类成分具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎及防治心脑血管疾病等作用[2-4]。笔者前期研究发现，延龄草中4 种甾体皂苷对心脑血管缺血性疾病具有较强的生物活性，说明此类皂苷具有成药性的可能。由于这4 种甾体皂苷的平衡溶解度和油水分配系数未见相关报道，本文对4 种甾体皂苷在不同溶剂中的平衡溶解度以及在不同pH 缓冲液中的油水分配系数进行测定，旨在预测其体内吸收状况，为后续制剂及新药研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters2695 高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；HY-5A 振荡器（上海力辰邦西科技有限公司）；CP225D 十万分之一分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ-700DE 超声清洗机（昆山超声仪器有限公司）；NP-30S 涡旋混合器（常州恩培仪器制造有限公司）；TGL-16C 离心机（天津广丰科技有限公司）；CT-6023 pH 计（杭州艾普仪器制造有限公司）。

1.2 试药

Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 对照品（实验室自制，纯度均大于98.0%）。乙腈、甲醇（色谱纯，德国默克公司）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、正辛醇、甲醇、磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 不同pH 的缓冲液 按2020年版《中国药典》四部通则8004 项下方法[5]，配制不同pH 值的磷酸盐缓冲液，使各缓冲液pH 值分别为2.0、3.0、5.0、6.0、7.0、7.8。用pH 计检测各缓冲液的pH 值，并进行校正。

2.1.2 正辛醇水饱和溶液的制备 吸取正辛醇溶液适量，分别与同体积水混合置于500 mL 带塞的锥形瓶中，室温下于恒温振荡器上振荡24 h，离心，分取上层和下层，即得水饱和正辛醇、正辛醇饱和水溶液，备用[6]。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取5.00 mg Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 对照品， 分别置于5 mL 量瓶中，加甲醇超声溶解5 min，定容，摇匀，即得质量浓度均为1.00 mg·mL-1的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 对照品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（45∶55）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，延龄草4 种甾体皂苷Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 的保留时间分别为11.94、6.58、5.39、4.96 min，结果见图1。

图1 4种甾体皂苷对照品的色谱图Fig 1 HPLC chromatogram of 4 steroidal saponins reference substance

2.3 4 种甾体皂苷含量测定的方法学考察

2.3.1 标准曲线的绘制 精密量取“2.1.3”项下各对照品溶液适量，稀释得最终质量浓度分别为0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600、0.800、1.000 mg·mL-1的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 系列标准溶液。经0.45 μm 微孔滤膜过滤后，分别进样测定，记录峰面积。以药物质量浓度（X，mg·mL-1）为横坐标，峰面积值（Y）为纵坐标，进行线性回归分析，得回归方程，结果见表1，Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 在质量浓度0.025 ～1.000 mg·mL-1内与峰面积呈良好的线性关系。

表1 4种甾体皂苷的标准方程及线性范围 (n ＝8)Tab 1 Standard equation and linearity of 4 steroidal saponins (n＝8)

2.3.2 精密度试验 取Y1T、Y2T、Y3T、Y4T对照品溶液，连续测定6 次，结果4 种甾体皂苷RSD值分别为0.32%、0.44%、1.1%、1.7%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取pH 值7.8 缓冲液（为4 种物质的最大溶解度）的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T水饱和正辛醇溶液6 份，进样测定其峰面积，计算RSD值分别为3.0%、0.39%、1.5%、1.4%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取Y1T、Y2T、Y3T、Y4T对照品溶液，于室温下放置0、2、4、8、16、24 h，进样测定其峰面积，根据其质量浓度计算出RSD值分别为2.3%、2.2%、2.3%、2.0%，表明4 种对照品溶液于室温下放置24 h 稳定。

2.4 4 种甾体皂苷平衡溶解度的测定

2.4.1 在不同介质中的平衡溶解度 分别取过量的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T，置2 mL 具塞离心管中，分别加入1 mL 水、甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇超声溶解10 min，使成饱和溶液后，置于25 ℃恒温振荡器中，200 r·min-1振荡8 h，离心（12 000 r·min-1，10 min），各吸取上清饱和液，经适当稀释后，过0.45 µm 的微孔滤膜，进样测定，记录峰面积，结果见表2。

表2 Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 在不同介质中的平衡溶解度(n ＝3)Tab 2 Equilibrium solubility of Y1T，Y2T，Y3T，and Y4T in different solvents (n ＝3)

2.4.2 在不同pH 溶液中的平衡溶解度 分别取过量的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T，置5 mL 具塞离心管中，分别加入3 mL 不同pH 值2.0、3.0、5.0、6.0、7.0、7.8 的磷酸盐缓冲液，超声溶解10 min，使成饱和溶液后，置于25 ℃下恒温振荡器中，200 r·min-1振荡8 h，离心（12 000 r·min-1，10 min），分别吸取上清饱和液，经旋转蒸发器适当浓缩后，过0.45 µm 微孔滤膜，进样测定，记录峰面积，结果见图2。

图2 4种甾体皂苷在不同pH 缓冲液中的平衡溶解度（n ＝3）Fig 2 Equilibrium solubility of 4 steroidal saponins in different pH buffers（n ＝3）

2.5 油水分配系数的测定

分别取质量浓度为0.5 mg·mL-1的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 水饱和正辛醇溶液1 mL，分别加入pH 值为2.0、3.0、5.0、6.0、7.0、7.8 的磷酸盐缓冲液1 mL，置于2 mL 具塞离心管中，涡旋混匀30 min，置于25 ℃下恒温振荡器中，100 r·min-1振荡12 h，静置后，3500 r·min-1离心10 min，小心吸取上层油相，过0.45 µm 的微孔滤膜，精密吸取续滤液10 µL，进样测定，记录峰面积，按标准曲线分别计算其浓度，并按下式计算表观油水分配系数P＝（CV-CwVw）/CwVw，式中P为皂苷的表观油水分配系数，C为正辛醇中皂苷的初始浓度，V为水饱和正辛醇的体积（即1 mL），Cw为分配平衡时皂苷在水相中测得的浓度，Vw为水相的体积（即1 mL）。按照公式计算不同pH 磷酸盐缓冲溶液中表观正辛醇缓冲溶液分配系数，结果见表3。

表3 4种甾体皂苷在不同pH 缓冲溶液中的油水分配系数(n ＝3)Tab 3 Oil-water partition coefficients of 4 steroidal saponins in different pH buffers (n ＝3)

3 讨论

3.1 测定介质的选择

目前关于延龄草中4 种甾体皂苷平衡溶解度测定的相关报道较少，本文结合以往的研究经验选择4 种甾体皂苷在5 种常用溶剂介质水、甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇和不同pH 溶液的平衡溶解度进行测定，并对其在不同pH 溶液中的油水分配系数进行测定，使研究更加系统和全面，可为延龄草中4 种甾体皂苷在药物制剂方面的研究提供更多参考依据。

3.2 pH 对4 种甾体皂苷平衡溶解度的测定结果分析

药物溶解是药物在体内吸收的前提，故水溶性是药物吸收的先决条件[7]。若溶解速度大于吸收速度，吸收过程与剂型关系较小；反之，溶解则会成为药物吸收的限速因素[8-9]。本研究结果显示：在pH 在2.0 ～7.8 时，4 种甾体皂苷的平衡溶解度总体呈现上升趋势；当pH 为7.8 时4 种甾体皂苷的平衡溶解度达到最大值分别为46.869、54.054、71.355、63.034 mg·L-1；而当pH 在5 ～6时，4 种甾体皂苷的平衡溶解度出现较低值。结果说明4 种甾体皂苷水溶性均较差，其中Y3T 和Y4T 的水溶性略大于Y1T 和Y2T，后续的剂型设计中可考虑加入辅料改善其水溶性，增加溶出度，进而提高其生物利用度。

3.3 pH 对4 种甾体皂苷油水分配系数的测定结果分析

药物的油水分配系数用于预测膜的通透性，包括胃肠道吸收、穿过血脑屏障的情况以及与药动学性质的关系，是药物成药性的考察指标之一[10]。由于胃肠道不同位置的pH 不同，如胃1.0 ～3.0，十二指肠4.0 ～6.0，空肠6.0 ～7.0，回肠7.0， 结肠7.8 ～8.0[11]， 因此选择pH 2.0 ～7.8 的缓冲液作为溶剂。若药物的logP值在-1 ～2 内，则该药物脂溶性和水溶性适中，具有较好生物膜渗透性，一般认为在胃肠道有较好吸收的药物logP＞1[12]。本研究测定了4 种甾体皂苷的油水分配系数，结果显示4 种甾体皂苷在水饱和正辛醇-不同pH 磷酸盐缓冲溶液体系中的logP具有一定的规律：Y1T 在pH 2.0 ～7.8内的logP值基本趋势保持不变，这说明Y1T 的logP值对pH 值依赖性不强；Y2T 在pH 3 和6 的缓冲溶液中logP值为1.345、1.038，说明Y2T 在胃肠道中有较好的吸收，亲脂性较好，适合口服给药；Y3T 在pH 3 的缓冲溶液中logP值达到最大（为0.884），说明Y3T 脂溶性较Y2T 弱；Y4T在pH 2.0 ～7.8 内logP值随着pH 的升高而减小，说明随着pH 的升高其脂溶性减弱，亲水性增强，口服吸收利用度下降。

3.4 展望

综上所述，根据本试验对延龄草4 种甾体皂苷的平衡溶解度和油水分配系数的测定结果可知，机体对延龄草4 种甾体皂苷的吸收性较好，按照生物药剂学分类系统分类可知，4 种甾体皂苷均属于低溶解度、高透过性的药物。所以，研制4 种甾体皂苷口服制剂的关键在于增加药物在体内的溶出度，进而有利于提高其生物利用度，为4 种甾体皂苷的成药性以及后续剂型研究奠定基础。