基于高效液相色谱指纹图谱的天麻饮片-标准汤剂-配方颗粒对比研究

王辙远，张璠璠，王隆隆，杨忠杰，陈恒文，于晓涛，王瑞*（. 漯河市中心医院，河南 漯河 46300；. 中国中医科学院广安门医院，北京 00000）

天麻为兰科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥块茎，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效[1]。天麻最早记载于《神农本草经》，历代本草学都把天麻列为“上品”，素有“补益上药，天麻第一”的美誉[2]。研究表明天麻化学成分复杂，主要为天麻素、天麻苷元及其他的酚类、有机酸类、甾醇糖类和氨基酸，对循环、神经、骨骼、消化、内分泌、泌尿系统等病症均有潜在的治疗作用[3-5]。

标准汤剂（standard decoction，SD）是指以中医理论为指导、临床应用为基础，参考现代提取方法，标准化工艺制备而成的单味饮片水煎剂[6]。标准汤剂是中药研发质量控制及提升的重要举措[7]。中药配方颗粒（Chinese medicine formula granules，CFG）是指运用现代技术以单味中药为基础进行提取、浓缩、制粒、分装等工艺制成的一种粉末或颗粒状制剂[8-9]。中药配方颗粒保留了传统中药复方临证加减的特点，又具有免煎煮、易携带等优势，促进了中药剂型创新的进程，由于缺少科学统一的质量控制标准，导致中药配方颗粒质量良莠不齐[10]。

目前，关于天麻的研究较多，但多集中在单独药材、化学成分或配方颗粒等的研究，没有以天麻饮片（gastrodia pieces，GP）、标准汤剂、配方颗粒三者为基础进行的HPLC 指纹图谱相关性和差异性的研究[11-13]。

本研究采用HPLC 法建立天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒的指纹图谱，同时测定多指标成分含量，比较三者间化学成分种类和量的差异，揭示三者间联系，为天麻配方颗粒的临床应用和研究提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；YRE-2000B 型旋转蒸发仪（河南省予华仪器有限公司）；SB25-12D 超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；FW-80 型微型高速万能试样粉碎机（天津市工兴电器厂）；AUW-120D 型十万分之一电子天平（日本SHIMADZU公司）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；5810R 高速离心机（美国Eppendorf 公司）。

1.2 样品

12 批天麻饮片均购买于漯河市4 家医院及2家药店，经河南中医药大学苗明三教授鉴定均为兰科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥块茎。12批天麻配方颗粒购买于漯河市4 家医院和郑州市2 家医院，详情见表1。

表1 天麻饮片与配方颗粒信息Tab 1 Gastrodia pieces and formula granule information

1.3 试药

天麻素（批号：DST190922-062， 纯度：99.58%）、对羟基苯甲醇（批号：DSTDD012301，纯度：99.99%）、巴利森苷A（批号：DSTDB-010201，纯度：98.39%）、巴利森苷B（批号：DSTDB006401，纯度：98.87%）、巴利森苷C（批号：DSTDB006501，纯度：99.9%）、巴利森苷E（批号：DSTDB006601，纯度：98.67%）（对照品，成都德思特生物科技有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher 公司），磷酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；水为饮用水或超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent 1260 高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0 ～10 min，5%B；10 ～25 min，5% ～40%B；25 ～30 min，40%B；30 ～31 min，40%～5%B；31 ～36 min，5%B）；进样量10 μL；流速1 mL·min-1，柱温30℃，检测波长220 nm[11-12]。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液 取天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 对照品适量，加甲醇分别制成质量浓度为1.96、2.01、2.18、3.11、2.88、1.99 mg·mL-1的储备液；精密量取上述各储备液适量，混匀，制得含天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 分别为490.39、138.06、122.94、120.56、110.71、154.79 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 参考《中国药典》2020年版一部方法，取12 批天麻饮片各10 g，加100 mL 50%甲醇，超声30 min，补足称重，静置，取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜，得12 批天麻饮片供试品（GP1 ～GP12）[1]。

取12 批天麻饮片各20 g，置于250 mL 圆底烧瓶中，加水180 mL，充分浸润30 min，加热回流30 min，趁热过滤，收集滤液，药渣加水140 mL，回流20 min，趁热过滤；滤液合并，降压浓缩至200 mL，静置，取上清液，过0.22 µm 微孔滤膜，得12 批天麻标准汤剂供试品（SD1 ～SD12）[11]。

取相当于10 g 天麻饮片的配方颗粒样品，加热水（80 ℃）100 mL，使完全溶解，静置，取上清液，过0.22 µm 微孔滤膜，得12 批配方颗粒供试品（A 厂：CFG1 ～CFG3、B 厂：CFG4 ～CFG6、C 厂：CFG7 ～CFG9、D 厂：CFG10 ～CFG12）[14-15]。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系考察 精密取“2.2.1”项下混合对照品溶液，用甲醇稀释成系列混合对照品溶液，进样分析。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得线性回归方程、线性范围及相关系数，结果见表2。

表2 各化学成分的回归方程、相关系数和线性范围Tab 2 Regression equation，correlation coefficient and linearity

2.3.2 精密度试验 取GP1 供试品溶液，连续进样6 次，以巴利森苷E 为参照峰，计算得各主要共有特征峰相对保留时间的RSD均≤1.0%，相对峰面积RSD均≤1.6%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取GP1 样品，平行制备6 份供试品溶液，进样测定，以巴利森苷E 为参照峰，计算得各主要共有特征峰相对保留时间的RSD均≤0.9%，相对峰面积RSD均≤1.2%，表明方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取GP1 供试品溶液，分别在0、3、9、24、48 h 测定，以巴利森苷E 为参照峰，计算得各主要共有特征峰相对保留时间的RSD均≤1.0%，相对峰面积的RSD均≤1.2%，表明供试品在48 h 内稳定。

2.3.5 加样回收试验 取已知含量的GP1 样品9 份，精密加入各成分质量分数的50%、100%、150%的混合对照品溶液，混匀，制备供试品溶液，进样分析。结果6 种成分平均回收率均在98.08%～102.0%，RSD均小于2.0%，表明方法准确度良好。

2.4 指纹图谱研究

取“2.2.2”项下饮片、标准汤剂及配方颗粒供试品各12 批，进样分析，记录色谱图，建立天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒的指纹图谱。结果饮片供试品相似度均超过了0.963，共标定13个共有峰；标准汤剂供试品相似度均大于0.978，共标定12 个共有峰，其中相对于饮片样品缺少了峰2；配方颗粒供试品相似度均大于0.899，共标定12 个共有峰，其中相对于饮片样品，缺少了峰2、峰8，增加了峰14（见图1）。

图1 天麻指纹图谱结果Fig 1 Fingerprint of gastrodia

2.5 化学成分指认

取混合对照品溶液、供试品（GP1）适量，进样分析，记录色谱图。根据化学对照品色谱、供试品溶液色谱比较，共指认6 个色谱峰，分别为峰6（天麻素）、峰7（对羟基苯甲醇）、峰9（巴利森苷E）、峰11（巴利森苷B）、峰12（巴利森苷C）、峰13（巴利森苷A），见图2。

图2 化学成分指认图Fig 2 Chemical composition identification

2.6 样品含量测定

按“2.1”项下色谱条件，同时测定天麻饮片、标准汤剂、配方颗粒供试品中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A 的含量。以12 批GP 样品中各成分质量分数均值为基准1，计算天麻饮片、标准汤剂、配方颗粒中各成分质量分数的相对值，见表3。

表3 天麻样品中各成分质量分数相对值结果Tab 3 Relative value of the mass of each component in the gastrodia sample

2.7 指纹图谱的比较

2.7.1 化学成分种类和数目比较 通过指纹图谱比较，天麻饮片、标准汤剂、配方颗粒的共有峰稍有差异，但基本保持稳定，这可能与提取过程中化学成分间的络合、氧化、分解、成盐等反应有关[15]。

2.7.2 指纹图谱相关性比较 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”对天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒色谱图分析。以S1 为参照图谱（采用中位数法、时间宽度为0.2 min），进行多点校正和峰匹配，评价样品相似度。结果与饮片（0.935）相比，标准汤剂（0.972）的相似度较高，配方颗粒（A 厂：0.879、B 厂：0.866、C 厂：0.854、D 厂：0.863）相似度稍低。说明与配方颗粒相比，标准汤剂更具有优势；配方颗粒中各厂家存在较小差异，这可能与各厂家的制备工艺有关[16]，提示了统一制备工艺、加强质量管理的重要性。

2.7.3 共有峰总峰面积比较 以天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒共有的特征峰（11 个，峰1，峰3 ～峰7，峰9 ～峰13）为研究对象，计算天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒共有峰总峰面积的均值。以12 批饮片共有峰总峰面积的均值为基准1，计算标准汤剂及配方颗粒的相对值[6]。结果天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒共有峰总峰面积的相对值为饮片（1.00）、标准汤剂（0.91）、配方颗粒（A 厂：0.62、B 厂：0.47、C 厂：0.52、D 厂：0.65）。

2.7.4 已知化学成分含量比较 由表3可知，以12 批饮片中各成分质量分数的均值为基准1，计算天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒的相对值，结果与饮片相比标准汤剂中各成分质量分数相对值除巴利森苷A（0.654）有所降低外，其余5 种成分基本保持一致；配方颗粒中各成分质量分数相对值均有不同程度的降低，其中天麻素降低不明显（0.896），巴利森苷A 降低最为突出（0.204），6 种成分相对值顺序为天麻素＞巴利森苷C ＞对羟基苯甲醇＞巴利森苷E ＞巴利森苷B ＞巴利森苷A。采用GraphPad Prism8.0.2（263）软件将表3数据生成含量测定结果热图，颜色越深表明相对值越大；反之颜色越浅相对值越小（见图3）。

图3 天麻样品含量测定相对值结果热图Fig 3 Heat map of relative value of content in gastrodia sample

2.7.5 天麻样品聚类分析 将天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒供试品共有特征峰（11 个）峰面积数据及6 种指标成分含量测定的数据进行z-score标准化处理后，采用SPSS 20.0 软件分别对样品进行聚类分析。结果共有峰峰面积及指标成分含量测定的聚类结果一致，即在欧氏平方距离为10时，可将样品分为两类，其中CFG1 ～CFG12聚合为一类，其余样品为一类。采用SIMCA 14.1 软件对样品聚类分析和OPLS-DA 分析，以特征值＞1 为提取标准，共有峰峰面积数据组共得到4 个成分，累积方差贡献率94.6%，指标成分含量数据组共得到3 个成分，累积方差贡献率93.2%，均能概括色谱图绝大部分信息。结果，PCA 和OPLS-DA 均将样品分为两类，CFG1 ～CFG12 聚合为一类，其余样品为一类，与聚类分析结果一致，见图4。

图4 天麻样品聚类分析结果Fig 4 Cluster analysis of common peak area of gastrodia

根据上述结果，可知以饮片为基准，标准汤剂相比配方颗粒的优势明显；不同厂家的天麻配方颗粒间质量基本保持稳定[16]，这可能与配方颗粒的制备工艺等差异有关，提示了统一配方颗粒制备工艺的重要性和建立配方颗粒全面质量控制体系迫切性[6]。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本试验考察了不同色谱柱（Phenomenex、Agilengt、YMC），不同流动相[（乙腈-（0.1%磷酸-水）、乙腈-（0.05%磷酸-水），不同流速（1、0.8 mL·min-1）]，不同柱温（30、35 ℃），不同检测波长（220、270 nm）等对色谱图的影响，最终确定本研究的色谱方法。

3.2 指纹图谱比较的分析

本研究采用指纹图谱法比较了天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒间的差异，发现三者相似度均大于0.854，说明虽然受制备工艺差异影响，但是生药来源是基本相同的，所以相似度较高[6，17]。共有峰数由饮片的13 个，标准汤剂的12 个到配方颗粒的12 个，说明三者在化学成分种类上基本一致，通过共有峰总峰面积的比较，发现与饮片相比标准汤剂及配方颗粒均有不同程度的降低，天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒的相对值为饮片（1.00）、标准汤剂（0.91）、配方颗粒（A 厂：0.62、B 厂：0.47、C 厂：0.52、D 厂：0.65），说明标准汤剂与饮片相比基本保持一致，而配方颗粒中各成分的含量相对于饮片均有不同程度降低，提示了配方颗粒标示量与实际量存在误差，在临床应用中应进行修正。

3.3 指标成分选定及比较分析

天麻中化学成分复杂，以往天麻仅用天麻素与对羟基苯甲醇为评价指标，不能全面评价天麻的产品质量，本文增加了巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 4 个成分，以上均是天麻重要的活性成分，具有抗惊厥、镇痛、镇静、祛风通络等多种药理作用[2-4，18-19]，故本文选择上述6 种成分为指标成分研究天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒的相关性和差异。

本研究通过对比天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒中6 种成分的含量测定结果，发现与饮片相比标准汤剂中各成分质量分数除巴利森苷A 降低外，其余5 种成分基本保持一致；配方颗粒中各成分质量分数均有不同程度的降低，其中天麻素降低不明显，巴利森苷A 降低最为突出。说明与饮片及标准汤剂相比配方颗粒中各化学成分含量有不同程度的降低，提示配方颗粒建立全面质量控制标准的重要性。

3.4 小结

综上分析，天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒化学成分种类基本保持一致，但各成分质量分数存在一定差异，其中配方颗粒中含量降低较为突出，反映了配方颗粒应加强质量控制、调整临床使用当量，以促进天麻配方颗粒的临床合理应用。本研究采用指纹图谱和化学模式识别方法，从定性和定量两个方面，对比天麻饮片、标准汤剂及配方颗粒的相关性与差异，课题组今后将从临床疗效和谱效关系继续深入研究，以期为天麻的临床应用提供参考。